毛细管电泳原理及分析策略.ppt

电渗流的活塞流特点 Hydrodynamic flow Parabolic Resistance to flow at surface More diffusion/broader detection zone EOF gives plug flow Minimizes band broadening Narrows detection zone 第三十一页，共八十一页。 Hydrodynamic flow Parabolic Resistance to flow at surface More diffusion/broader detection zone EOF gives plug flow Minimizes band broadening Narrows detection zone 电渗流的活塞流特点 第三十二页，共八十一页。 电渗流是CE中最大的驱动力来源之一 第三十三页，共八十一页。 电渗流的正面及负面作用 正面作用 增加分离速度 使得正、负电荷物质同时分离 负面作用 减少分离时间和分离有效距离 电渗流的波动极大的影响了迁移时间的重复性 第三十四页，共八十一页。 影响电渗流的因素 pH值 pH越高，电渗流越大 离子强度 离子强度越高，电渗流越小 缓冲溶液添加剂 离子型表面活性剂、有机溶剂、环糊精 第三十五页，共八十一页。 电渗流随pH的变化情况 第三十六页，共八十一页。 控制电渗流的三个重要手段 采用涂层毛细管，消除电渗流的影响 改变pH，从而调整电渗流的大小。pH3时电渗流很低；当pH10以后，电渗流基本不增加 添加剂：有机溶剂可以降低电渗流的大小，从而增加分离的有效距离；表面活性剂可以彻底改变电渗流的方向和大小，主要是在阴离子分析时使用 第三十七页，共八十一页。 缓冲溶液的影响和选择 在CE中应该根据以下性质来选择缓冲溶液： 在所选的pH范围内有较强缓冲能力； 在检测波长处有低的紫外吸收； 小的淌度（即大体积、低电荷离子）以降低所产生的电流。 那些被称为生物“优良缓冲液”的，如Tris, borate, CAPS等特别有用，因为这些缓冲溶液中的离子一般较大，能够在较高浓度下使用而不会产生大的电流，但一个潜在的缺点是这些大的缓冲离子有强的紫外吸收。 第三十八页，共八十一页。 常用的CE缓冲体系 磷酸钠体系 宽缓冲范围 硼酸钠体系 高pH范围 Tris-HCl体系 低pH范围 醋酸-醋酸铵体系 CE/MS常用体系 第三十九页，共八十一页。 CZE分离条件的选择 毛细管类型--涂层还是非涂层？ 毛细管长度--长毛细管还是短毛细管？ 缓冲液体系--种类和pH值 添加剂类型--甲醇|环糊精|乙腈 检测器选择--紫外|二极管阵列|激光诱导荧光 第四十页，共八十一页。 缓冲溶液的选择 可先用磷酸缓冲体系为搜寻基础，初步确定（最佳）pH范围后，再进一步细选出更好pH和缓冲试剂。磷酸盐是毛细管电泳中最常用的缓冲体系之一，它的紫外吸收低，pH缓冲范围比较宽（pH=1.5～13），但电导也比较大。 第四十一页，共八十一页。 缓冲溶液及pH值的选择 研究经验表明：对于蛋白质、肽和氨基酸等两性样品，采用酸性（pH 2）或碱性（pH＞9）分离条件，比较容易得到好的分离结果；糖类样品通常在pH=9～11之间能获得最佳分离；羧酸或其他样品多在pH=5～9之间选择分离条件。 第四十二页，共八十一页。 缓冲溶液及pH值的选择 pH 的选择也和所用的毛细管种类有关，许多涂层毛细管只能在一定的pH范围内工作，例如聚丙烯酰胺涂层毛细管，在3＜pH＜8的范围以外工作，其涂层容易水解失效。 第四十三页，共八十一页。 缓冲溶液及pH值的选择 在相同的 pH下，不同缓冲体系的分离效果不尽相同，有的可能相差甚远。一般的经验是，能与样品发生相互作用的试剂，有可能就是最好的试剂。一个典型的例子是，在分离糖类和DNA等分子时优先使用硼酸盐缓冲体系，因为硼酸根能与糖羟基形成配位键，从而增加糖的负电荷和分离度。硼酸缓冲试剂也适用于其他含邻位羟基或多羟基化合物的分离。 第四十四页，共八十一页。 缓冲溶液及pH值的选择 缓冲试剂及pH调节剂的浓度也需要优化。缓冲试剂的浓度一般控制在10～200 mmol/L之间。电导率高的缓冲试剂如磷酸盐和硼砂等，其浓度多控制在20 mmol/L附近，而电导小的试剂如硼酸及HEPES等，其浓度可在100 mmol/L以上。有时为了抑制蛋白质吸附等特殊目的，可采用很高（＞0.5mol/L）的试剂浓度，此时要注意减少分离电压，分析速度自然也将随之降低。 第四十五页，共八十一页。 添加剂的选择 目的： 改善分离 抑制分析物在毛细管上的吸附 第四十六页，共八十一