细胞免疫荧光染色.docxVIP

细胞免疫荧光染色 a． 将待分析的细胞传代，铺在事先放置了细胞爬片的24孔板内，细胞不宜过密，否则会影响荧光染色观察单个细胞。 5000个/200ul，可以通过加到孔里粗略观察密度。 b． 培养一段时间后，待细胞贴壁即可开始细胞免疫染。 c. 取上述24孔板，加入500ul含有Ca2+ 、Mg2+的PBS，置于4℃摇床上摇晃3分钟，洗去培养基和杂质，此步重复2次。(可常温) d． 吸取多余的PBS，每孔加入400ul 4%的多聚甲醛用于固定，4℃摇床上摇晃30分钟。 e． 移去多聚甲醛，继续加入400ul的PBS洗去残余的液体，常温洗3次，每次3分钟。 f． 用PBS配制成0.1M/L氯化铵溶液，向每孔加入300ul，室温培育10分钟，用PBS洗两次，每次三分钟。 g． 0.5% Triton X-100 4℃孵育30min，在细胞膜上穿孔，便于染色，之后用PBS洗2次，每次3分钟。 h． TBST配制1%BSA 4℃封闭1小时。TBST 10X的话，用超纯水稀释。 i． 一抗4℃封闭过夜，移去一抗，TBST洗5次，每次3分钟。 j． 二抗4℃避光孵育1小时，移去二抗，TBST洗4次，每次3分钟，PBS洗3分钟。 k． DAPI核染，4℃染色4分30秒，TBST洗3次，每次3分钟。储存液配成10mg/ml，200ul每管，于避光管中，-20℃保存。工作液为10u