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罗氏沼虾诺达病毒检测RT-PCR法 1范围 本标准规定了罗氏沼虾诺达病毒RT-PCR检测法的原理、试剂与材 料、仪器设备、操作方法和结果判定。 本标准适用于罗氏沼虾诺达病毒的检测2规范性引用文件 以下文件对于本文件的应用是必不可少的。但凡注日期的引用文 件，仅所注日期的版本适用于本文件。但凡不注日期的引用文件，其 最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法 SC/T 7202. 1斑节对虾杆状病毒病诊断规程 第一局部：压片显 微镜检查法3原理 3.1罗氏沼虾诺达病毒 罗氏沼虾诺达病毒 (Macrobrachium rosenbergii nodavirus, 板NV)呈二十面体，大小为26 nm?27 nm,无囊膜，基因组由两条正 链RNA组成，RNA1编码病毒RNA多聚酶，RNA2编码结构蛋白。助rNV是罗 氏沼虾白尾病(White tail disease, WTD)的主要病原，可以经水 带。阳性对照在423 bp和205 bp处无DNA条带出现或阴性对照在 423 bp或205 bp处有DNA条带出现都说明此次试验无效，应在排除 故障和清除污染后，重新取样检测。 待检样品第一次PCR扩增后经电泳在423 bp处有DNA条带出现, 或第二次PCR后经电泳在205 bp处有DNA条带出现均可判为罗氏沼 虾诺达病毒核酸阳性，记为MrNV ( + )。 待检样品经PCR扩增后电泳没有出现DNA条带，或条带的大小不 是423 bp或205 bp的均可判为罗氏沼虾诺达病毒核酸阴性，记为 MrNV (-) o 注5：检测结果凝胶电泳图按附录A。 8废弃物处理8.1采样及样品处理所用物品的处理 采样及样品处理过程中的废弃物、所用容器等，都经收集后高压 灭菌处理。 8. 2核酸抽提及PCR加样所用物品的处理 因加入Trizol后病毒被灭活已无感染性，故核酸抽提及PCR加样 过程中的废弃物除Trizol和氯仿需回收处理外可直接丢弃处理。 8.3电泳所用物品的处理 本标准使用无毒的核酸染料进行PCR产物的染色，故电泳过程中 的废弃物可直接丢弃处理。 附录A （规范性附录）检测结果判断图示 M. DNA分子量标准 (DL1000)；,阳性对照（ +）； .阴性对照（-）；.空白对照（-）； 注：“205 bp”为扩增的MrNV目的片段大小； “ 十 ”表示阳性;-表示阴性。 图A. 1罗氏沼虾诺达病毒套式R1PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图 (资料性附录)试剂溶液的配制方法 DEPC水的制备焦碳酸二乙酯(DEPC) ： 1 mL； 将1 mL DEPC加入1000 mL双蒸水中配成0. 1 %的水溶液。室温作 用12h以上，其间间歇摇混几次或在室温下磁力搅拌20min,然后121 ℃ 高压灭菌15 mine分装，室温保存。 0.5 mol/L EDTA (pH8. 0)的配制二水乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2-2乩0) ： 186. 1 g； 在800 mL DEPC水中加入186. 1 g EDTA-Na2 - 21120,用磁力搅拌器 搅拌助溶，用约20 g的氢氧化钠调节pH值至8.0,然后加DEPC水定容 至1000 mL,分装后121 ℃高压灭菌15 min。室温保存。 75%乙醇的配制无水乙醇：750 mL； 加DEPC水定容至1000 mL, 4 ℃保存。 TN缓冲液的配制Tris： 2. 42 g； 氯化钠：23. 38 g； 在800 mL DEPC水中加入2. 42 g Tris和23. 38 g氯化钠,用盐酸 调节pH值至7. 4,然后加DEPC水定容至1000 mL,分装后121 ℃高压灭 菌15 mino室温保存。 Tris-硼酸电泳缓冲液(TBE)配制B. 5. 1 5XTBE Tris： 54. 0 g；硼酸：27.5 g； 0. 5 mol/L EDTA (pH8. 0) ： 20 mL； 在800 mL双蒸水中加入54. 0 g Tris. 27. 5 g硼酸和20 mLO. 5 mol/L EDTA (pH8. 0),用磁力搅拌器搅拌助溶，完全溶解后加双 蒸水定容至1000 mL；室温保存。 1 XTBE5XTBE： 200 mL； 加双蒸水定容至1000 mL；室温保存。 15 g/L琼脂糖凝胶制备(含核酸染料) 称1. 5 g琼脂糖溶于100 mL 1XTBE中，微波炉加热至完全融化， 冷却至50℃左右，加入10 uL GelRed核酸染料，轻轻摇匀，将梳子插 入制胶板内，倒入琼脂糖溶液，凝固后取下梳子，4 C保存备用。 （资料性附录） 本方法局部词汇中英文对照 中文名称英文名称 Taq DNA聚合酶Taq DNA polymerase脱氧核糖核甘三磷酸