糖化酶摇瓶实验.pdfVIP

实验四 糖化酶摇瓶实验 一）实验目的 掌握糖化酶摇瓶实验的基本操作。 二）实验原理 摇瓶培养是实验室常用的通风培养方法，通过将装有液体培养物的三角瓶放在摇床上 振荡培养，以满足生物生长、繁殖及产生许多代谢产物对氧的需求。 三）实验材料 1、菌种 黑曲霉（Aspergillus niger）。 2、培养基 玉米粉 12g，豆饼粉4g,麸皮2g,水200ml。 3、器材 500ml 三角瓶，载玻片，摇床等 四）方法步骤 1、配制培养基 玉米粉 6%，豆饼粉 2%，麸皮 1%。补足水分，原料浸入水中。8 层纱布+牛皮纸包扎，0.1MPa 下灭菌30min。 500ml 三角瓶 1 瓶/小组。装液量分别为100ml 2 个小组、200ml 2 个小组 2、接种 成熟斜面，在无菌条件下，注入 10ml 无菌水，振荡成孢子悬浮液。待发酵培养基灭菌后冷 却到30～32℃时，分别将孢子悬浮液接入三角瓶中，接种量为2ml，做好标记。 3、培养 将三角瓶固定在摇床上，培养温度为31℃，转速为200rpm/min，培养时间为96h。 4、 显微镜观察菌丝形状，测量发酵液pH，测定糖化酶活力。 【实验结果】 1、比较三种不同装液量条件下的菌体形状特征、酶活力，将结果填入表格 接种量 100ml 200ml 菌丝体数比 100ml 中的 菌丝生长呈扩散形，具有 多且孢子体数量也较多。菌丝 菌体特征 大量球形孢子，少数菌丝有横 中有横隔出现，孢子囊呈球 隔，菌丝体大多呈管状。 形，并处于不同生长分裂时 期。 pH 2.5 4.0 实验五 糖化酶的分离和提取 一）实验目的 掌握酶工程中的一些分离和提取方法。 二）实验原理 酶的分离提取首先要除去发酵液中的悬浮固形物，获得澄清的酶液；然后进行适当浓度 的浓缩；其次将酶沉淀，然后收集沉淀；干燥、磨粉、获得粉状制剂。 黑曲霉糖化酶是一种胞外酶，提纯工艺比较简单。首先采用过滤法将菌体等杂质除去， 继而对滤液进行浓缩，最后将酶沉淀出来，对沉淀物进行干燥，加工成成品。 糖化酶的沉淀可采用硫酸铵盐析法，也可采用有机溶剂如乙醇沉淀。 三）实验材料 1、液体培养 将黑曲霉从斜面转接到液体三角瓶，28度，200rpm 培养96h 2、溶液及试剂 盐酸、无水乙醇、硫酸铵等 3、器材 漏斗、离心机、抽滤泵、抽滤瓶、蒸发器、布氏漏斗、天平、干燥箱、定量滤纸 四）方法步骤 1、发酵液过滤 取成熟的发酵液，在漏斗中用滤布过滤除去菌体。菌体用２０ml水洗涤，抽滤。合并清夜， 量总体积 2、浓缩 将总滤液放入蒸发器中浓缩到 1/3～1/5体积，测定酶活。 3.沉淀 将浓缩液均分为二，一份用盐酸调节ph至3.5。在 10～20℃条件下加入3.5倍冷冻的无水酒 精，边加边搅拌，即可发现酶的沉淀现象。沉淀物用布氏漏斗抽滤，并称酶泥的重量。另一 份按55g/100ml加硫酸铵，静止盐析 1h。沉淀物用布氏漏斗抽滤，测酶活。 实验六 糖化酶活力测定 一）实验目的 掌握糖化酶活力测定的原理与方法。 二）实验原理 糖化酶能从淀粉分子非还原性末端开始，分解α-1, 4 葡萄糖苷键生成葡萄糖。葡萄糖 分子中含有醛基，能被次碘酸钠氧化，过量的次碘酸钠酸化后析出碘，再用硫代硫酸钠标准 溶液滴定，由此可计算酶活力。 碘量法原理为在碱性介质（NaOH）中，碘歧化为次碘酸钠和碘化钠，次碘酸钠氧化溶 液中游离的醛基为酸基。