苦参碱对肝卵圆细胞增殖模型大鼠Notch1Jagged1mRNA表达的影响.docVIP

苦参碱对肝卵圆细胞增殖模型大鼠Notch1Jagged1mRNA表达的影响 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：苦参碱对肝卵圆细胞增殖模型大鼠Notch1Jagged1mRNA表达的影响 1 1材料和方法 2 文2：苦参碱对肝卵圆细胞增殖模型大鼠Notch1Jagged1mRNA表达的影响 4 1材料和方法 4 参考文摘引言： 9 原创性声明（模板） 11 文章致谢（模板） 11 正文 苦参碱对肝卵圆细胞增殖模型大鼠Notch1Jagged1mRNA表达的影响 文1：苦参碱对肝卵圆细胞增殖模型大鼠Notch1Jagged1mRNA表达的影响 0引言 卵圆细胞作为肝脏的干细胞在肝细胞损伤修复及癌变过程中起重要作用，但目前关于卵圆细胞的来源、特性、分化增殖的调控机制尚不十分清楚. 研究证实多种细胞因子参与了卵圆细胞分化发育的调节过程［1-2］. 本实验建立了大鼠肝卵圆细胞增殖模型，观察了卵圆细胞在肝组织内的分布及Notch1, Jagged1 mRNA在该模型中的表达情况，并探讨了苦参碱对其的作用. 1材料和方法 1.1材料苦参碱标准品购自中国药品生物制品检定所，二乙酰氨基芴（2AAF）购自Sigma公司，兔抗大鼠Thy1 IgG购自Santa Cruz公司，Notch1, Jagged1引物由上海生物工程公司合成，Trizol总RNA提取试剂盒, dNTPs, Oligo(dT)15Primer, MMLV逆转录酶、Tag DNA聚合酶均为美国Promega公司产品. 雄性SD大鼠48只，体质量130±20 g,由河北医科大学实验动物中心提供. 1.2方法雄性SD大鼠48只随机分为模型组（A组），苦参碱小剂量组（B组，按每100 g大鼠5 mg苦参碱灌胃），苦参碱大剂量组(C组，按每100 g大鼠25 mg苦参碱灌胃),正常对照组（D组）. A, B, C组饲以含0.15 g/L二乙酰氨基芴（2AAF）饲料1, 1 wk末按经典术式行2/3肝大部分切除术（PH），此后继续饲以含0.15 g/L二乙酰氨基芴（2AAF）饲料4, 5 wk末实验结束；B, C组于造模同时开始灌胃给药至实验结束；D组常规饲养以等量生理盐水灌胃. 分别于第3, 5 wk末，肝脏取材，一部分固定于40 g/L甲醛中准备石蜡包埋切片行HE染色，另一部分快速置于液氮中准备行冰冻切片免疫组化染色及RTPCR检测. Notch1免疫组化染色采用PV二步法,按试剂盒说明操作. 染色结果采取半定量分析： 每组随机选6只动物，高倍镜下每张切片随机选择5个视野,应用MPIAS500高清晰度彩色图文分析系统对染色阳性部位灰度值进行定量分析. 用RTPCR方法检测肝组织中Notch1, Jagged1 mRNA表达水平. 总RNA抽提： 应用Trizol(一步法)总RNA提取试剂盒提取肝组织总RNA，采用分光光度法测定提取的总RNA含量及纯度，A260/A280之间，计算出提取总RNA浓度. 反转录：按Promega公司CDNA合成试剂盒说明操作，取RNA15 μg, MMLV反转录酶1 μL，总反应体积25 μL, 37℃反转录50 min, 95℃ 5 min灭活反转录酶. 引物设计： Notch1 mRNA引物序列参照Yuji Nishikawa等［3］发表的文献： 上游： 5′ atc cat ggc tcc atc gtc ta3′， 下游 5′ttc tga ttg tcg tcc atc ag 3′，产物422 bp; Jagged1 mRNA引物序列参照Charlotte HJ等［4］发表的文献： 上游: 5′ atg cgg tcc cca cgg acg cg3′， 下游: 5′aca ctc agg acc cat cca gc 3′ ，产物687 bp. 大鼠βactin引物序列：上游 5gcc atg tac gta gcc atc ca3，下游 5gaa ccg ctc att gcc gat ag3，产物375 bp. PCR总反应体积为25 μL包括： 2×Tag PCR MasterMix 12.5 μL,上、下游引物混合共2 μL,反转录的CDNA 1 μL,补ddH20至25 μL . 扩增条件为： Notch1: 94 ℃预变性5 min, 94℃变性30 s, 50℃退火30 s, 72℃延伸5 min, 35个循环. Jagged: 94℃预变性5 min, 94℃变性30 s, 57℃退火30 s, 72℃延伸5 min, 35个循环. 取RTPCR产物4 μL，加上样缓冲液1 μL，在15 g/L琼脂糖凝胶（含EB）上电泳，80 V, 45