Chapter离子交换和体积排除色谱课稿课件.pptxVIP

液相色谱基础离子交换与体积排除色谱吸附/分配色谱离子交换色谱（IEC）原理保留的影响因素例子体积排除色谱（SEC）原理校正曲线凝胶过滤与凝胶渗透影响保留的因素例子离子交换色谱的机制离子交换平衡离子交换的类型强强交换剂在pH 2 至12的范围内保持离子状态弱交换剂在pH 改变时可能会变为非离子化状态弱硅胶型的离子交换剂优点高柱效小颗粒没有收缩或膨胀机械稳定性好能耐受有机溶剂价格低缺点2 pH 7低容量（meg/g）聚合物基础上的离子交换聚苯乙烯－二乙烯基苯的合成（PSDVB）其他聚合物基础上的离子交换例, 甲基丙烯酸酯离子交换树脂的合成聚合物基质的离子交换优点1 pH 12高容量（meq/g）缺点机械稳定性不好会收缩或膨胀机械稳定性不好能耐受的有机溶剂的量是有限的离子交换能力指交换剂结合离子的能力通常填料meq/g来装填若不考虑填充密度，可引起误解（can be misleading）聚合物型：5meq/g,密度 0.2g/ml →1meq/ml硅胶型： 1.5meq/g,密度 0.5g/ml →0.75meq/ml容量越大，需要越强的流动相洗脱强度对弱离子交换，取决于流动相的pH值交换能力与pH值的关系在离子交换色谱中影响保留的因素流动相的离子强度（k）pH (k, α)抗衡离子的浓度(k, α) 温度(k, α) 影响平衡共存离子(α) 有机溶剂(k, α) 克服反相的影响/与疏水基团的相互作用色谱柱类型，强或弱离子交换剂离子强度的影响pH 值的影响不同离子的洗脱强度阳离子交换剂 Ba2+Pb2+Ca2+Ni2+Cd2+Cu2+Co2+Zn2+Mg2+Mn2+Ag2+Cs2+Rb2+K+NH4+Na+H+Li+Li是最弱的阴离子交换剂 柠檬酸盐3-SO22-草酸盐2-I-NO3-CrO4-Br-SCN-Cl-]醋酸盐-OH-F-氟化物是最弱的温度的影响40℃流动相：1M KH2PO4，pH 3.8柱温：60℃流速：4ml/min色谱柱：Silica SCX50℃60℃IEC－应用氨基酸典型的应用，由Moore 和Stein在上世纪50年代末发展而来蛋白质无机离子也称离子色谱氨基酸的离子化用IEC分离氨基酸色谱柱：阳离子交换柱洗脱剂A：0.2 N Na+ pH=3.0洗脱剂B：0.2 N Na+ pH=9.8梯度：0-100% B in 48 min流速：0.4 ml/min用IEC分离蛋白质可应用于多有的蛋白质对生物活性有非常好的重现性对电荷差别特别小的蛋白质分离能力非常强对浓度小体积大的样品分离能力很好是可分离的质量数最高可有多种途径改善分离效果选择离子交换剂类型的原则蛋白质电荷是pH的函数＋pl，等电点阳离子交换剂阴离子交换剂－pH用于蛋白质分离的离子色谱类型阴离子阳离子强季胺磺酸磺酸盐弱二乙基氨乙基 (Diethylamine,DEAE)羧甲基(Carboxymethyl ,CM)填料粒径：5-40μm色谱柱内径：5-50mm 长度 5-30cm选择合适的pH值净电荷数蛋白质表面电荷问题：你认为这三种蛋白质哪一种会最后一个被洗脱出来？注：这三种蛋白质的净电荷均等于－1pH值对蛋白质分离的影响色谱柱：Protein –Pak DEAE 8HR 10×100mm（阴离子交换）流速：1.5ml/min梯度：0-200mM NaCl缓冲盐：20mM TRIS-HClC=Conalbumin （伴清蛋白）T=Transferrin （铁传递蛋白）O=Ovalbumin （卵清蛋白）S=Soybean trypin inhibitor（大豆胰岛素抑制剂）pH梯度用于pH梯度的Waters Auto BlendTM 方法蛋白质的分离－反离子的影响SCNaClO色谱柱：Protein –Pak DEAE 8HR 10×100mm(阴离子交换)流速：1.5ml/min缓冲盐：20mM TRIS-HCl pH 7.5梯度：0-200mM NaCl 0-200mM NaAcetateC=Conalbumin （伴清蛋白）T=Transferrin（铁传递蛋白）O=Ovalbumin （卵清蛋白）S=Soybean trypin inhibitor（大豆胰岛素抑制剂）TCNaAcetateSOT蛋白分离的共离子效应色谱柱：Protein –Pak SP 8HR 10×100mm(阴离子交换)流速：1.5ml/min梯度：0-300mM NaCl缓冲盐：20mM Na Phosphate pH 5.520mM Na Acetate pH 5.5A=Alpha Chymotrypsinogen(α胰凝乳蛋白酶原)R=Ribonuclease A（核糖核酸酶）C=Cytochrome