如何做好免疫印迹.pptVIP

巧妙的改进，出色的结果 左：10%SDS PAGE后用前述不连续缓冲体系半干转印，转印后印迹膜用考马斯蓝R250染色；中：转膜后凝胶考染；右：Western Blot检测该印迹膜上p47蛋白。泳道1、2分别为Kaleidoscope 蛋白标准品和细胞全蛋白 1 2 1 2 216kD 132kD 第三十一页，共五十五页，2022年，8月28日 特殊转印要求下仪器和试剂的选择 应用 转印缓冲液 印迹膜 推荐仪器 蛋白测序 CAPS PVDF/NC 槽式转印 大分子蛋白 Towbin with SDS, 不连续体系 PVDF/NC 槽式转印 小分子蛋白或多肽 Towbin，CAPS PVDF 槽式转印 碱性(pI9), 变性胶 CAPS NC/PVDF 槽式/半干转印 碱性(pI9), 非变性胶 0.7% 乙酸 NC/PVDF 槽式转印 糖蛋白 Towbin(with SDS), CAPS NC/PVDF 槽式/半干转印 蛋白多糖 Towbin NC/PVDF 槽式/半干转印 第三十二页，共五十五页，2022年，8月28日 两种转印系统的比较 半干转 湿转 每块mini胶所需缓冲液的量 ~20ml 500－700ml 所需时间 ～30分钟(大分子量蛋白应适当延长) 30~60分钟(很大分子量蛋白适当延长) 冰浴 不需要 需要 适用范围 150KD 无限制 第三十三页，共五十五页，2022年，8月28日 电压,电流,功率 设置恒电压时,电阻下降,电流加大,会产高热,须降温(半干除外) 设置恒电流时,电压和功率随电阻下降而下降,产热也会降低,以后随场强下降,转印速度也会下降. 设置恒功率时,电流随电阻下降而升高,升高的速度较恒电压时低,所以设置恒功率近似恒电流 第三十四页，共五十五页，2022年，8月28日 Semi-dry blot Transfer mini gels for 15–30 minutes at 10–15 V. Large gels can be transferred for 30 minutes to 1 hour at 15–25 V. Do not exceed 25 V with this instrument. A current limit (3 mA/cm2 for large gels; 5.5 mA/cm2 for mini gels) is recommended to prevent excessive heating during the run. 第三十五页，共五十五页，2022年，8月28日 湿转 第三十六页，共五十五页，2022年，8月28日 第三十七页，共五十五页，2022年，8月28日 第三十八页，共五十五页，2022年，8月28日 用Bio-Dot 或 Bio-Dot SF进行斑点或狭缝印迹 直接真空抽滤上样至印迹膜 方便快速，可高温消毒，适于高通量筛选 第三十九页，共五十五页，2022年，8月28日 转膜后检测 丽春红S染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤 膜，换水几次。 印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针的 Western印迹过程。 注：染色法不适合蛋白结合力较强的PVDF膜和尼龙膜 第四十页，共五十五页，2022年，8月28日 封闭 目的：封闭膜上多余的蛋白结合位点，减少非特异性反应 封闭液脱脂奶粉或BSA (5％) 溶于TBST (100mmol/L Tris-Cl, 9g/L NaCl, 5g/L Tween 20)溶液中 封闭时间：37℃一小时，4℃过夜 第四十一页，共五十五页，2022年，8月28日 常用封闭液 试剂 膜 浓度 备注 明胶 NC 1-3% 明胶加热溶解 脱脂奶,BLOTTO NC,PVDF 0.5-5% PVDF所需浓度要高 BSA NC,PVDF 1-5% PVDF所需浓度要高 TWEEN20 NC 0.05-0.3% 可能有杂带 第四十二页，共五十五页，2022年，8月28日 一抗、二抗孵育 根据滤膜面积以0.1ml/cm2的量加入封闭液配制的一抗液与滤膜温育。37℃一小时，4 ℃过夜 倒掉一抗溶液，用TBST液滤膜3次，每次5min 加入用封闭液配制的二抗溶液，37℃一小时，4℃过夜 倒掉二抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3-5次，每次10min。 第四十三页，共五十五页，2022年，8月28日 印迹膜检测 第四十四页，共五十五页，2022年，8月28日 第四十五页，共五十五页，2022年，8月28日 全蛋白检测－负离子染色