临床检验初级检验技师：荧光抗体技术.docxVIP

一、荧光抗体的制备 荧光抗体技术是以荧光素标记抗体，与切片中组织或细胞抗原反应，经洗涤分离后，在荧光显微镜下观察呈现特异性荧光的抗原抗体复合物及其部位，借此对组织细胞抗原进行定性和定位检测，或对自身抗体进行定性和滴度测定，此技术亦称荧光免疫组织化学技术。 (一)抗体要求 将荧光素与特异性抗体以化学共价键的方式结合而成。 用于标记的抗体应该具有高特异性和高亲和力。 (二)荧光素要求 实验室最常用的荧光素是异硫氰酸荧光素。 (三)抗体的荧光素标记 1、搅拌法 2、透析法 (四) 荧光素标记抗体的纯化 1、透析法 2、层析法 (五) 荧光素标记抗体的鉴定 1、荧光素与蛋白质的结合比率 2、抗体效价 荧光抗体制备完成后应对其活性加以鉴定。可以采用双向免疫扩散试验测定抗体效价，抗原含量为1g/L时，抗体效价1：16者较为理想。 3、抗体特异性 ①吸收试验：向荧光抗体中加入过量相应抗原反应后，再用于阳性标本染色，应不出现明显荧光。 ②抑制试验：阳性标本先与相应未标记抗体反应，洗涤后，再加荧光抗体染色，应受到明显抑制。 (六)荧光抗体的保存 荧光抗体的保存应注意防止抗体失活和防止荧光淬灭。最好小量分装，-20℃冻存可保存2～3年。真空干燥后可长期保存。稀释后的抗体不宜长时间保存，在4℃可保存1～3天。 二、标本的制作 常见的临床标本主要有组织、细胞和细菌三大类。 三、荧光抗体染色与结果判断 (一)直接法 特异荧光抗体直接滴加于标本上，使之与抗原发生特异性结合。 (二)间接法 可用于检测抗原和抗体。本法有两种抗体相继作用，第一抗体为针对抗原的特异抗体，第二抗体(荧光抗体)为针对第一抗体的抗抗体。 (三)双标记法 用FITC及罗丹明分别标记不同的抗体，而对同一标本作荧光染色。在有两种相应抗原存在时，可同时见到橙红和黄绿两种荧光色泽。 (四)荧光抗体染色结果判断 标本的特异性荧光强度一般用“+”号表示。“-”为无或仅见极微弱荧光;“+”为荧光较弱但清楚可见;“++”为荧光明亮;“+++”为耀眼的强荧光。临床上根据特异性荧光强度达“++”以上判定为阳性，而阴性对照应呈“-”或“±”。根据呈“+”“-”的血清最高稀释度判定特异性抗体效价。 四、荧光显微镜的基本结构 (一)光源 通常用高压汞灯、氛灯或卤素灯作为激发光源。 (二)滤光片 滤光片分为隔热滤光片、激发滤光片和吸收滤光片。 (三)光路 分为透射光和落射光两种形式。 (四)聚光器 聚光器有明视野、暗视野和相差荧光聚光器等。 (五)镜头 目镜有氟处理、消色差和复消色差三类镜头，常用的是消色差镜头。