细胞工程第五章生物制品生产改.pptVIP

Namalwa 从患有淋巴瘤病的肯尼亚人获取，建成人的类淋巴母细胞系。非整体核型，12～14条标记染色体，单条X，无Y。 外源基因表达水平较高，培养基为RPMI1640 +7%胎牛血清。可用无血清培养基高密度培养。悬浮生长，表达IgM。 英国Wellcome公司用Namalwa细胞大规模生产α干扰素，反应器达8000L。用该细胞生产rhEPO、rhG-CSF、tPA等。 第六十页，共一百二十一页。 CHO-K1 从中国地鼠卵巢中分离的上皮样细胞。核型2n=20～22。 贴壁生长，也可进行悬浮培养，对剪切力和渗透压有较高的忍受能力。培养基为：DEME+ 0.1mmol/L次黄嘌呤+0.1mmol/L胸苷+10%小牛血清+脯氨酸。 分泌表达外源蛋白，蛋白质翻译后的修饰准确，表达产物的结构、性质和生物活性接近天然。使用氨甲酰喋呤可增加外源基因的拷贝数，提高蛋白质表达水平。是目前使用最为普遍和成熟的表达糖基化蛋白药物的宿主细胞。 第六十一页，共一百二十一页。 BHK-21 从1日龄地鼠幼鼠肾脏中分离的成纤维样细胞，核型为2n=44。 培养基为DMEM+7%胎牛血清。 用于增殖病毒、制备疫苗和重组蛋白。现已用于工程细胞构建。 第六十二页，共一百二十一页。 Vero 从正常成年非洲绿猴肾脏分离的上皮细胞，贴壁生长，核型2n=60。 能适应灌流操作，进行连续培养。培养基：M199+5%胎牛血清。已有突变系能用无血清培养。 常用Vero E6增殖多种病毒，包括多瘤病毒、脊髓灰质炎、狂犬病毒、乙脑病毒等，生产病毒性疫苗，已被批准用于人体。也可作为转染的宿主细胞，用于表达外源基因的蛋白质药物和病毒的检测。 第六十三页，共一百二十一页。 SP2/0-Ag14 通过融合的方法分离获得。 培养基为DMEM+10%胎牛血清。能耐受8氮鸟嘌呤 20μg/mL，但在HAT选择培养基中不能存活。 通常用于生产单克隆抗体。 第六十四页，共一百二十一页。 C127：从小鼠乳腺瘤分离的上皮样细胞。贴壁生长。表达多种外源基因，其中EPO的水平达10 mg/L，生产rhGH已被批准上市。 3T3：HIN Swiss小鼠胚胎培养中分离的细胞系。能大量表达外源蛋白，广泛用于药物毒理学研究。 COS：从SV40 DNA转化的非洲绿猴肾细胞CV1中分离得到的，广泛用于外源基因瞬时表达的研究。 GH3：用于生长激素研究， 293：用于基因治疗的研究。 第六十五页，共一百二十一页。 昆虫细胞株系 Sf-9 从秋粘虫的卵巢细胞（SF21）中分离得到的，是最常用的昆虫表达细胞。 通常用Grace培养基+3.3g/L 水解乳蛋白+3.3g/L酵母浸液+10%胎牛血清。抗机械剪切，能在无血清培养基的搅拌反应器中生长。 对苜宿尺蠖核型多角体病毒和其它杆状病毒高度敏感。生长快，能高效表达外源基因。用于高效表达外来蛋白制品。 第六十六页，共一百二十一页。 其他 Sf21：从秋粘虫卵巢细胞中分离得到，细胞较大，容易放大，高效表达外源基因。 TN-5B1-4：从粉纹夜蛾卵细胞中分离得到的。无血清培养，快速倍增。分泌表达重组蛋白的能力比Sf9细胞系高20多倍，能适应悬浮培养。 第六十七页，共一百二十一页。 四、基因工程细胞构建和筛选 在生产中采用更多、更有前景的是融合细胞及各种基因工程细胞。 被用于构建工程细胞的动物细胞有： CHO-dhfr 、BHK-21、 Namalwa、Vero、 SP2/0、 Sf-9 等细胞。 第六十八页，共一百二十一页。 1.真核细胞基因表达载体的构建 使用的载体有两类： 病毒载体-- 牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒 质粒载体-- 第六十九页，共一百二十一页。 病毒作为载体的优点： ①双链DNA，易重组； ②插入7～8kb DNA不影响正常病毒粒子的形成 ③多角体蛋白和病毒粒子的形成无直接关系。因此，用外源基因更换多角体蛋白基因，仍能形成有感染力病毒粒子； 第七十页，共一百二十一页。 ④多角体蛋白基因有非常强的启动子，产生的蛋白质可占全部蛋白质的20%～30%； ⑤用光学显微镜可看到多角体，可以此作为标记物，选阳性克隆。 ⑥如家蚕杆状病毒，可在蚕体表达外源基因。 第七十一页，共一百二十一页。 质粒载体 与微生物的质粒载体类似，一般是穿梭质粒，具有两个复制子和抗性筛选标记基因。 大肠杆菌的复制子，细菌中繁殖。 抗生素抗性标记，原核细胞筛选。 动物细胞复制子，在宿主细胞中 稳定表达。还有丝状噬菌体复制子。 第七十二页，共一百二十一页。