第十六章基因诊断.ppt

四、血友病 是一种遗传性凝血功能障碍的出血性疾病，由于正常凝血过程中血浆凝血的活力有缺陷所致。患者常因出血不止或继发病而夭折，治疗主要靠替代疗法，输入缺乏的血浆因子。重型血友病甲和乙的男性发病率为1/5000~1/50000。为甲型血友病和乙型血友病。 主要特征： ①是一组X连锁遗传凝血缺陷疾病。 ②缺乏Xq远端的FⅧ（凝血因子Ⅷ）所致。 ③基因突变具极为异质性，与β地贫不同。（因子占X染色体全长0,1%，共186kb包括26个外显子）不存在存族和群体特异性，几乎每一种不同的甲型血友病家系都具有自已独特的突变类型。（所以该病基因诊断不宜用PCR/ASO探针直接检测点突变，而主要依赖RFLP连锁分析） ①也是X连锁遗传的凝血缺陷疾病。 ②约1%左右乙型血友病人FIX基因缺失（因而在用替代疗法过程中会产生FIX的抑制物）。 ③在非缺失（FIX基因）型中，已发现398种不同的基因突变。 （FIX基因定位在Xq26→q27，全长34kb包括8个外显子）。 第三十一页，共六十四页。 ①已克隆化FIXcDNA和DNA片段，鉴定了FIX基因的5个限制者多态性位点，故可用RFLP连锁分析进行产前诊断和携带者检测。 ②病倒：乙型血友家系分析FIX基因发现某患者缺失该基因5kbDNA序列（第2~3外显子+第2内含子全部+部分第1，第3内含子） a、对该家系一例乙型血友病变高危妊娠产前基因诊断，诊断胎儿为男性乙型血友病患者。 b、对该孕妇第二胎产前诊断为女性乙型血友病基因携带者。 （上海医遗传所淅江乙型血友病家系） 4、诊断情况（报道）： ①应用克隆化FⅧcDNA与VIII基因连锁DNA片段和DX18、St14等分析了基因或旁侧的限制酶酶切位点多态性，并采用PCR/BCLI或XbaI RFLP连锁分析法进行了甲型血友病的产前诊断和携带者检测。 ②用PCR/SSCP法检查了FVIII内含子18处BCL I的多态性。 （终止妊娠对胎儿作凝血子测定和DNA分析、证实产前诊断正确。） 第三十二页，共六十四页。 类 别 基因特征 诊断方法 1、病毒性肝炎 ①甲型肝炎（HAV） ①甲肝病毒基因是线状分子、约含于7500个核苷酸。 ②已获HAV几个毒株cDNA克隆。 ①CDNA探针杂交（RNA）法。②SSRNA探针杂交（RNA）法有报道。 ②乙型肝炎（HBV） ①HBVDNA约3.3kb，是非共价闭合的环状结构。 ①PCR斑点杂交法。 ②PCR电泳EB染色法 ③丁型肝炎（HDV ①HDV基因为环状SSRNA长约1678个核苷酸 ①DNA或cDNA探针杂交（RNA）法 ②RT/PCR单抗ELISA法 2、细菌引起的疾病（1）产毒性Ecoli、侵袭性Ecoli;(2) 霍乱弧菌；（3）痢蒺杆菌；（4）淋球菌基因诊断用PCR扩增斑点杂交法。 3、疟疾、寄生虫基因诊断用PCR或结合探针技术。 二、传染病的基因诊断 第三十三页，共六十四页。 三、肿瘤的基因诊断 （一）基因重排的生理和病理 基因重排—指某些基因片段改变原来存在的顺序，通过调整有关基因片段的连接顺序，再重排为一个完整的转录单位 1.生理 （1）基因表达DNA水平的调控方式之一。 （2）免疫球蛋白分子多样性的分子机理之一。 2.病理 重排和重组位点之间DNA片段移除，会使在恒定区两侧的某些限制酶切位点的位置发生改变。可用： （1）限制性片段长度改变； （2）分子杂交（恒定区域连接区基因为探针）。 确定基因重排的存在与否，以对肿瘤进行基因诊断。 第三十四页，共六十四页。 免疫球蛋白重链基因探针（J）和轻链基因探针（k，入）对B细胞 淋巴瘤DNA的杂交图谱。 说明： 1、正常对照 2、B细胞淋巴瘤， 入基因无重排 ，重排后杂交端的位置 实验： 提取瘤细胞DNA→酶切（至少2组以上）杂交（至少两种以上）→结论（看到2组以上的杂交图谱改变时，即可下诊断结论）。 1 2 J 1 2 1 2 k 入 （二）基因内部重排与B细胞淋巴瘤 第三十五页，共六十四页。 （三）基因间重排（染色体易位） 淋巴样肿瘤细胞的染色体易位 癌基因 肿 瘤 染色体易位 发生频率 C-myc …… …… …… ……