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无忧PPT整理发布 关于核酸分子杂交 第一页，共三十九页，2022年，8月28日 主讲内容 核酸分子 杂交 的基本原理 核酸探针 核酸分子 杂交技术 第二页，共三十九页，2022年，8月28日 一、DNA的变性（denaturation） 变性：在一定的条件下，DNA双螺旋之间的氢键断裂，解离成两条无规则的卷曲状单链DNA分子，此现象称为变性。 第三页，共三十九页，2022年，8月28日 复性：去除变性因素后，单链DNA通过碱基互补配对原则重新结合成稳定的双螺旋结构，这一过程称为复性。 二、DNA的复性 (renaturation) 退火 淬火 第四页，共三十九页，2022年，8月28日 根据核酸变性和复性的原理，来源不同的两条单链核酸分子通过碱基互补配对形成异源双链杂交体的过程。 三、核酸分子杂交 杂交的基础：核酸分子单链之间的碱基互补配对。 注：分子杂交可以在DNA与DNA、RNA与RNA、RNA与DNA的两条单链之间进行。 第五页，共三十九页，2022年，8月28日 核酸分子的浓度 温度 离子强度 核酸分子的复杂性 影响核酸分子杂交的因素 第六页，共三十九页，2022年，8月28日 四、核酸分子杂交技术 通过标记的单链核酸探针与固相支持物上或液相中单链的互补靶序列退火形成双链杂交体，而定性或定量检测特异DNA或RNA的技术。 第七页，共三十九页，2022年，8月28日 第二节 核酸探针 核酸探针的概念 核酸探针的类型 核酸探针的标记 核酸探针的检测方法 第八页，共三十九页，2022年，8月28日 核酸探针( nucleic probe )：指能够与待测的靶核酸片段互补结合的带有特殊可检测标记的核苷酸片段。 一、概念 第九页，共三十九页，2022年，8月28日 按化学本质分： DNA探针 RNA探针 按标记物分： 放射性标记探针 非放射性标记探针 按分子大小分： 寡核苷酸探针 单链探针 双链探针 二、核酸探针的类型 第十页，共三十九页，2022年，8月28日 二、常见核酸探针 1.基因组DNA探针 2.cDNA探针 3.RNA探针 4.寡核苷酸探针 来源于某种生物的基因组，为某 一基因的全部或部分序列。 来源于cDNA,不含有内含子序列，适用于基因表达研究。 大多以单链形式存在,杂交效率高。可通过体外转录技术获得。 用化学合成技术在体外合成的单链DNA,长度一般为20-50bp。 第十一页，共三十九页，2022年，8月28日 三、核酸探针的标记 1.核酸探针的标记物 （1）放射性核素标记物 常用放射性核素标记物有： 32P、35S、 3H 优点：①灵敏度极高,可检测到10-14 ～ 10-18g的物质，在最适 条件下，可以测出样品中少于1000个分子的核酸含量，光谱分析法只能鉴定10-9g的物质。 ②对碱基配对的特异性和稳定性无影响。 ③特异性高。 缺点：放射性污染，有半衰期。 第十二页，共三十九页，2022年，8月28日 32P或35S同位素标记的单核苷酸 （α） （γ） （OH）H OH 第十三页，共三十九页，2022年，8月28日 (2)非放射性标记物 优点：无放射性污染，稳定性好，可以较长时间存放， 处理方便。 缺点：灵敏度、特异性不够理想。 常用非放射性标记物有：生物素、地高辛、酶、荧光素 第十四页，共三十九页，2022年，8月28日 2.核酸探针的标记方法 （一）酶促法 缺口平移法 随机引物法 DNA探针末端标记法 （二） 化学法 预先标记 酶促反应 转移 探针 第十五页，共三十九页，2022年，8月28日 （1）缺口平移法 （nick translation） 由DNA酶Ⅰ和大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ共同完成。 酶促法 第十六页，共三十九页，2022年，8月28日 随机引物：含有各种可能排列顺序的六核苷酸片段的混合物。 （2）随机引物法（random priming） 酶促法 第十七页，共三十九页，2022年，8月28日 在5’或3’端通过酶促反应加上标记物 DNA聚合酶ⅠKlenow片段3’末端标记法 T4多核苷酸激酶5’末端标记法 聚合酶链反应标记DNA探针 RNA探针的标记 寡核苷酸链探针的标记 （3）探针的末端标记