核酸分子杂交七年制.pptVIP

2．印迹方法 Mechanics of transfer 虹吸印迹法（Capillary） 真空转移法（Vacuum） 电转移法（Electrophoretic） Blot DNA to membrane 第三十一页，共四十九页，2022年，8月28日 Capillary Blotting (upward) no special equipment required! 1975年 E. Southern Southern DNA 印迹转移技术 DNA片段1kb，1小时 DNA片段15kb，18小时 第三十二页，共四十九页，2022年，8月28日 Electrophoretic blotting 不宜用硝酸纤维素膜 一般2~3小时， 最多6 ~8小时 especially good for small fragments resolved by PAGE 第三十三页，共四十九页，2022年，8月28日 Vacuum blotting 30~60分钟 more efficient and quantitative than capillary must apply vacuum evenly and not too strongly 第三十四页，共四十九页，2022年，8月28日 3．印迹类型 Southern印迹杂交 Northern印迹杂交 斑点及狭缝印迹杂交 反向斑点杂交 菌落或噬菌斑杂交 第三十五页，共四十九页，2022年，8月28日 提取DNA 限制性内切酶消化 琼脂糖凝胶电泳 碱变性 转移到NC膜，高温烘烤 与DNA或RNA探针杂交 放射自显影 Southern blotting hybridization 检测靶分子为DNA, 检测靶分子是否含有目的基因。 可用于 基因组基因的定性及定量分析、 克隆基因的酶切图谱分析、 基因突变分析等。 预杂交 第三十六页，共四十九页，2022年，8月28日 关于核酸分子杂交七年制 第一页，共四十九页，2022年，8月28日 核酸分子杂交（nucleic acid molecular hybridization）是指用标记的已知DNA或RNA片段检测样品中未知核酸序列，通过碱基互补配对原则发生同源性结合，再经显影或显色的方法，将结合的核酸序列的位置或大小显示出来。 探针( probe )：带有可检测标记的已知序列的DNA或RNA片段。 第二页，共四十九页，2022年，8月28日 应用：克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。目前核酸分子杂交不仅在分子生物学领域中具有广泛地应用, 而且在临床基因诊断上的应用也日趋增多。 检测对象: 克隆化的基因组DNA,、细胞总DNA、总RNA。杂交方法不同，被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交, 即细胞原位杂交。 核酸分子杂交特点：高度的灵敏性(pg) 、高度的特异性 第三页，共四十九页，2022年，8月28日 第一节 核酸分子杂交的基本原理 一、变性（denaturation） 二、复性（renaturation） 三、杂交（hybridization） 四、预杂交（prehybridization） 第四页，共四十九页，2022年，8月28日 基本原理：DNA变性、复性与分子杂交 第五页，共四十九页，2022年，8月28日 Hybridization 第六页，共四十九页，2022年，8月28日 Tm ：50%DNA解链的温度，又称融解温度。 （G、C含量）Tm = 69.3 + 0.41*(G +C) % 融解温度：50％杂化核酸分子解链温度称为寡核苷酸探针的Tm值。 寡核苷酸探针的长度、碱基的含量和核酸的序列决定了探针的Tm值。 实际操作中，常选择低于Tm值5-10℃进行杂交。 Tm=4 ℃ X（G + C）+ 2℃ X（A + T） 第七页，共四十九页，2022年，8月28日 杂交温度： Tm=81.5℃ + 161.6logM + 0.41（G + C）% - 500/n - 0.61（甲酰胺%） M为Na+摩尔浓度，n为探针的复杂性 例如，一个长度为500bp的探针，（G+C）含量为50%，杂交体系中含5 X SSC（0.75mol/L Na+）和50%甲酰胺，则其Tm值为： Tm=81.5℃ + (-2.07) + 20.5 – 1 – 30.5=68.4 ℃ 50%甲酰胺溶液, 温度一般选择低于 Tm值20-25℃ 杂交温度应:68.4 ℃ - 25 ℃=43.2 ℃ 甲酰胺是一种变性剂，能干扰碱基堆积力和氢键的形成，降低核酸