核酸扩增技术.pptVIP

基因组中某个基因在同种生物的不同个体中，同时和经常存在的两种或两种以上的变异型，以至于用某种限制性核酸内切酶消化基因组的某段序列时，会呈现不同长度的消化片段，形成生物群体的多态性，这种多态性称为限制性核酸内切酶片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP) 第六十二页，共九十八页，2022年，8月28日 EcoR I 5’-GAATTC-3’ 5’-NNNNNNNGAATTCNNNNNN-3’ 5’-NNNNNNNG AATTCNNNNNN-3’ P1 P2 第六十三页，共九十八页，2022年，8月28日 5’-NNNNNNNGAATTCNNNNNN-3’ 5’-NNNNG AATTCNNN-3’ 5’-NNNNNNNGTATTCNNNNNN-3’ EcoR I 5’-NNNNNNNGTATTCNNNNNN-3’ EcoR I + _ + _ 第六十四页，共九十八页，2022年，8月28日 RFLP的优缺点 RFLP用于检测点突变 可以确定点突变的位置 第六十五页，共九十八页，2022年，8月28日 二、等位基因特异性寡核苷酸 Allele specific oligonucleotide, ASO是用寡核苷酸探针和PCR产物进行杂交以检测点突变的方法。 被检基因片段经PCR扩增并经电泳分离后转移到膜上，分别与经标记的含有正常序列和突变序列的寡核苷酸探针杂交。 PCR产物仅与完全互补的探针杂交 现在位置 P185 第六十六页，共九十八页，2022年，8月28日 野生型基因DNA 突变型基因DNA 野生型基因DNA探针 突变型基因DNA探针 第六十七页，共九十八页，2022年，8月28日 野生型基因DNA探针 突变型基因DNA探针 结论：不存在点突变 第六十八页，共九十八页，2022年，8月28日 野生型基因DNA探针 突变型基因DNA探针 结论：存在点突变 第六十九页，共九十八页，2022年，8月28日 DNA片段在琼脂糖凝胶上电泳分离 膜上固定DNA片段 在缓冲液中将标记的探针加到膜上 DNA片段从琼脂糖凝胶上转印到膜上 杂交信号的检测 第七十页，共九十八页，2022年，8月28日 ASO的优缺点 用于检测点突变 由于探针的序列是已知的，可以确定点突变的位置 缺点是成本相对较高，检测一个点突变即需要一对引物和一对寡核苷酸探针 现在位置 P185 第七十一页，共九十八页，2022年，8月28日 三、单链构象多态性 单链构象多态性（Single strand conformation polymorphism, SSCP）当DNA分子以单链存在时，能在空间内自发地形成二级结构，这种二级结构的空间构象取决于DNA分子本身的的碱基构成，即使一个碱基的差别也会形成不同的二级结构。 SSCP用于检测点突变 缺点：不能确定突变的位置 现在位置 P186 第七十二页，共九十八页，2022年，8月28日 三、单链构象多态性 突变DNA的PCR产物经变性后产生与正常DNA空间构象不同的两条单链。在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中时，不同构象的单链片段具有不同的电泳迁移率，从而能区别正常与突变的DNA。 只适合于检测200bp以内的DNA靶基因片段 实验的关键是控制各种条件以避免在操作过程中DAN单链分子复性为双链。 现在位置 P186 第七十三页，共九十八页，2022年，8月28日 四、变性梯度凝胶电泳 现在位置 P186 DNA分子的物理特性之一是当DNA分子被加热至其融点温度时双链被打开。 融点温度取决于DNA分子本身的序列，不同序列的DNA分子具有不同的融点温度。 第七十四页，共九十八页，2022年，8月28日 变性梯度凝胶电泳技术正是利用了DNA分子的这一特性。 在设计引物时使被扩增目的片段的二端含有不同的Tm值，一端较高，另一端相对较低。 将这一PCR产物在由变性剂形成梯度的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，当其泳动至相应位置时，片段于Tm值较低一端的双链被部分解链，如此形成的构象至使该片段的电泳迁移率大大降低。 现在位置 P186 第七十五页，共九十八页，2022年，8月28日 ＋ － 变性剂浓度由低到高 Tm值低 Tm值高 第七十六页，共九十八页，2022年，8月28日 PCR扩增中的退火温度是根据引物的Tm值而决定的，二条引物的Tm值不能差别太大。 根据需要，合成引物时在其5’端可以加修饰成分 如加入酶切位点，用生物素、荧光素、地高辛等标记，引入突变位点，引入启动子序列，引入蛋白质结合DNA序列等。 现在位置 P171 引物设计时必须遵循的原则 第三十页，共九十八页，2022年，8月28日 三、 反应条件 1、温度 ①变性温度：一般把变性温度定