蛋白质组学及其在微生物学研究中的应用.pptxVIP

会计学; 第一节 引言 第二节 蛋白质组学研究基本技术 第三节 微生物蛋白质组学; 第一节 引言;;蛋白质组学的概念;对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，不是局限于一个或几个蛋白质。 同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同 。 在空间和时间上动态变化着的整体。;蛋白质组学(proteomics) ;;大规模的蛋白质分析过程;;蛋白质组学发展依赖于高通量分离、鉴定和解析蛋白质技术的进步。 重要技术突破主要包括三点： 固相化pH梯度二维电泳（IPG-2-DE)的发明与完善； 生物质谱，即应用软电离技术对生物大分子进行分析的质谱技术的发展； 生物信息学发展。;一、蛋白质组研究中的蛋白质分离;原 理 ;特 点;在IEF的电泳中，具有pH梯度的介质其分布是从阳极到阴极，pH值逐渐增大。而蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征，这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动，直至某一pH位点时失去电荷而停止移动，此处介质的pH恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点（pI）。同理，位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动，直到它们的等电点上聚焦为止。可见在该方法中，等电点是蛋白质组分的特性量度，将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带。 ; ;固相pH梯度等电聚焦的优点;第二向SDS电泳;双向电泳典型过程包括：;;2-DE技术的缺点 ;2、新型非凝胶技术 ;采用凝胶技术和非凝胶技术进行蛋白质组学研究的基本路线;在非凝胶分离技术中，高效液相色谱由于其分离原理多样，易于组合多维分离模式和与质谱直接联用而获得了广泛的研究和应用。 高效液相色谱的原理：溶于流动相中各组分经过固定相时，与固定相发生相互作用，由于相互作用大小、强弱的不同，各组分在固定相中滞留的时间不同，由此从固定相中流出的先后也不同，最终使不同组成成分得到分离。 经典的高效液相色谱系统由输液系统、进样系统、分离系统和检测系统构成。质谱起到了检测器的作用。;液质联用技术（LC-MS/MS）; 根据蛋白质带电性及疏水性???同，用MS分离多肽复合物。 ;二、生物质谱与蛋白质鉴定;■ 四极杆质谱（quadrupole,Q）、 ■ 离子阱质谱（ion trap,IT） 飞行时间质谱（ time of flight ，TOF ） 傅里叶变换离子回旋共振质谱（fourier transform cyclotron resonance, FTICR） ;电喷雾离子化（electrospray ionization ， ESI） 和基质辅助激光解吸电离（matrix-assisted laser desorption ionization ，MALDI）等软电离技术的发明和成熟才使质谱技术真正应用到生物大分子分析领域，使得在fmol(10-15)乃至attomole(10-18)水平检测相对分子质量高达几十万的生物大分子成为可能。这也使得有机质谱发展成为了一个崭新的领域——生物质谱。 ;;;“软电离”的特点;在蛋白质组学研究中，为了提高质谱的适用范围和工作性能，常将不同类型的质量分析器串联起来使用。因此，目前最为常用的质谱分析系统包括两大类： 以单一质谱为基础的 电喷雾－三级四级杆质谱 电喷雾－离子阱质谱 电喷雾－傅里叶变换离子回旋共振质谱 基质辅助激光解吸离子化－飞行时间质谱 以串联质谱为基础的 电喷雾－三级四级杆－飞行时间质谱 基质辅助激光解吸离子化－三级四级杆－飞行时间质谱 基质辅助激光解吸离子化－串联飞行时间质谱;（二）、应用生物质谱鉴定蛋白质;鉴定和注释蛋白质的路线 ;第35页/共54页; 仪 器 ;;组织切片或印片原位质谱分析技术 两级飞行时间串联质谱（MALDI-TOF/TOF） 傅里叶转换回旋共振质谱（FTMS） 表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS） ; 概念：把一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂体系中所有的蛋白质进行精确的定量和鉴定。 ; 低丰度蛋白质检测困难 蛋白质表达量差异很小，如在50%以下时，精确定量成为瓶颈 蛋白质表达的瞬时变化 ;;1．基于荧光染色技术的电泳定量法;;2、基于稳定同位素技术的质谱定量法;;三、 微生物蛋白质组学;病原微生物蛋白质组研究主要有以下几方面： （1）遗传与变异方面的研究 主要是通蛋白质研究结果与基因组预测的（开放阅读框）ORF相比较来较正基因组的研究结果。蛋白质组的研究结果可以对基因组的研究结果起到补充和修正的作用，而且通过同一致病菌不同菌株的蛋白质研究，可以对病株进行分类。;;;（二）、模式微生物