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CRISPR/Cas（clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated(Cas)）系统广泛存在于细菌及古生菌中, 是机体长期进化形成的RNA指导的降解入侵病毒或噬菌体DNA的适应性免疫系统。基于细菌的这种免疫功能，人们把Ⅱ型CRISPR-Cas系统改造成一种全新的人工核酸内切酶，从而使该系统能够对靶基因进行修饰。;1987年，日本课题组在K12大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列，随后的研究发现这种间隔重复序列广泛存在于细菌和古细菌的基因组中;3;TypeⅠ系统是CRISPR/Cas系统中Cas蛋白最 多和最复杂的系统，包含6个蛋白，其中有特征性的Cas3蛋白，该蛋白具有解旋酶和核酸酶功能。 TypeⅡ系统的主要特征是包含一个标志性的Cas9蛋白，参与crRNA的成熟以及降解入侵的噬菌体DNA或是外源质粒。目前Ⅱ型系统是被改造的最为成功的人工核酸酶。 TypeⅢ系统包含特征性的Cas10蛋白，主要参与crRNA的成熟和剪切入侵外源DNA 。;产脓链球菌的典型TypeⅡCRISPR/Cas基因座;Cas9 蛋白是由1409个氨基酸组成的多结构域蛋白, 含有2 个核酸酶结构域：氨基端的RuvC-like 结构域及位于蛋白中间位置的HNH核酸酶结构域, HNH核酸酶结构域可以切割与crRNA互补配对的模板链, 切割位点位于原型间隔序列毗邻 基序(Protospacer adjacent motif, PAM)上游3nt处,RuvC-like 结构域可以对另一条链进行切割, 切割位点位于PAM 上游3~8nt 处。在crRNA 与tracrRNA形成的双链RNA的指导下，Cas9蛋白对靶位点进行切割。;噬菌体或是质粒上与间隔序列对应的序列被称为protospacer（原间隔序列），通常protospacer的5‘或是3’端延伸几个碱基序列很保守，被称为PAM(protospacer adjacent motifs)，它的长度一般为2 —5碱基，一般与protospacer相隔1— 4个碱基，现在认为PAM序列为NGG。;;CRISPR/Cas9作用机制;第一阶段;;CRISPR基因座的表达;外源遗传物质的干扰;;CRISPR-Cas系统靶向要求;Cas9蛋白来源于细菌，因此要让Cas9蛋白高 效地转运到哺乳动物细胞核内，需要在Cas9蛋白的N端或是C端加上真核细胞的核定位信号。从目前发表的论文来看，在Cas9蛋白的C端添加核定位信号，似乎是提高Cas9蛋白的核转运最有效的方法。 ;;2013年初，MIT的张峰教授研究组首次报道利用CRISPR/Cas9系统对人293T细胞的EMX 1和PVABL基因以及小鼠Nero2A细胞的 基因实现了定点突变。研究还发现，把Cas9、crRNA及tracrRNA序列构建于同一个质粒上进行转染即可完成识别靶序列并切断双链DNA ，大大降低了操作的难度。;Martin等 对 于TypeⅡ型CRISPR/Cas9的改造做出了重大贡献，为进一步的应用打下坚实的基础。根据tracrRNA与crRNA的结构特性，他们将tracrRNA和crRNA表达为一条嵌合的向导RNA (guide RNA，gRNA)，并在体外证明gRNA可以发挥tracrRNA和crRNA的功能。;Jienk等对sgRNA进一步的研究表明, 延伸sgRNA序列的3′端能增加靶DNA的突变效率，这样会保留更完整的tracrRNA序列，结构上更加接近天然的crRNA： tracrRNA结构 ；sgRNA与Cas9的整合是Cas9介导DNA剪切的限速步骤。 ; 2013年1月29日在《nature biotechnology》上发表的《efficient genome editing in zebra fish using a CRISPR-Cas system》一文中，作者利用人工合成的sgRNAs能指导Cas9内源性核酸酶成功对斑马鱼胚胎基因进行修饰。;2013年2月15日在《science》上发表的《Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems》一文中，作者利用一个包含两个靶向不同基因spacers的crRNA实现了同时对两个基因进行编辑。 ;2013年5月9日在《cell》上发表的 《 One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering 》一文中，作者通过CRISPR/Cas系统实现了对小鼠胚胎干细胞上