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项目二十一细胞因子检测 一、白细胞介素-2的测定 (Determination of interleukin-2) 检测IL-2主要有两类方法，一类是生物活性检测，另一类是抗体检测法(或称为免疫分 析法)。生物活性检测法是通过检测IL-2反应敏感细胞对待检样本中IL-2的增殖反应程度对 IL-2进行分析，该方法比较敏感，但检测时间长，步骤多，影响因素多，因此结果简洁波动。 免疫分析法比较简洁、快速、牢靠，通过免疫分析法检测IL-2的方法也有很多，其中应用 较多的是采纳酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked Immunoabsobent Assay, ELISA),这里选取其 中较为有用、敏感性及特异性较好的双抗体夹心法加以介绍。 【试验原理】 将抗IL-2单抗结合到固相载体上形成固相抗体，然后通过加入待检标本，使标本中的 相应抗原IL-2与抗体结合形成免疫复合物，洗涤后加入生物素标记兔抗人IL-2多克隆抗体, 使之与免疫复合物中的IL-2抗原反应，再加入亲和素标记辣根过氧化物酶进行反应，最终 加底物显色，通过分析酶促反应强度检测标本中IL-2的含量。 【试剂与器材】 .抗体和标记物 包被用抗人IL-2单克隆抗体，生物素标记兔抗人IL-2多克隆抗体, 亲和素标记辣根过氧化物酶。 .包被缓冲液 O.lmol/LNazHPCU，用HC1调整pH值至9.0。 . PBS 80.0g NaCl, 11.6g Na2HPO4, 2.0g KH2PO4, 2.0g KC1,溶解于 10L 蒸储水中, 调整pH至7.0。 .洗涤液 含 0.05%(V/V)Tween-20 的 PBS, pH 值 7.0。 .封闭液 含10%(V/V)小牛血清或1 % BSA (W/V)的PBS液。 .样品稀释液 用封闭液加入0.05 %(V/V) Tween-20即可。 .底物 加I 150mg 2,2-连氮基-二(3-乙基-苯睡噪琳-6-磺酸)二胺盐(ABTS)于500ml 0.lmol/L枸椽酸溶液中，充分溶解后用NaOH调整pH值至4.35,分装后保存于-20℃备用。 用前每11ml底物溶液中加入H2O2 10|il o .终止液 20%SDS-50%DMF(将50ml DMF加入到50ml蒸储水中，然后加入20.0g SDS)o .温箱、聚苯乙烯酶标反应板、微量移液器、酶标检测仪。 【步骤与方法】 .包被 用包被液稀释鼠抗人IL-2单抗至适当浓度，加到聚苯乙烯酶标反应板中，每 孔最终一孔仅加包被液100111作为对比，加盖或用塑料粘纸封板，4℃作用过夜。 .封闭 弃去包被液，用洗涤液洗涤反应孔4次，甩干，每孔加封闭液200W，室温作 用lh。如不马上检测样品，可保留封闭液而置于4c备用。 .加样 弃去封闭液，用洗涤液洗涤反应孔4次，甩干，加用稀释液稀释的IL-2标准 品或标本液，每孔100(11，室温作用2?4h或4℃过夜。 .加二抗 弃去样品液，用洗涤液洗涤反应孔4次，甩干，加用样品稀释液适当稀释 的生物素标记兔抗人IL-2多克隆抗体，每孔lOOjil,室温作用lh。 .加亲合素-HRP弃去多抗液，用洗涤液洗涤反应孔4次，甩干，加用样品稀释液适 当稀释的亲和素标记辣根过氧化物酶，每孔室温作用30?60min。 .显色 弃去亲和素-HRP反应液，用洗涤液洗涤反应孔8次，甩干，加底物，每孔 100W，室温避光显色5?60min,或据室温适当缩短或延长反应时间，至阳性孔消失明显棕 黄色时加终止液，每孔50口，终止反应。 【结果判定】 .目测法 阳性孔呈桔黄色至棕黄色，阴性孔为无色或极浅的黄色。如需定量测定， 应采纳比色法。 .比色法 以空白对比调零，用酶标检测仪测A405值，画出标准曲线，并据标准曲线 确定样品中IL-2的含量。 【留意事项】 .应首先通过方阵滴定确定各抗体的最佳浓度，再进行正式试验。其中包被抗体浓度 一般以1?4|ig/ml为宜，而生物素标记二抗浓度以0.25?2.0|ig/ml为宜。 .检测标本应力求新奇，污染细菌的标本简洁产生非特异显色，因菌体内可能含有内 源性HRPo如需检测血标本，应避开溶血，因红细胞溶解后会释放出具有过氧化物酶活性 的产物。 .为确保结果精确，应常规设重复孔，如一次用多块板进行试验，应考虑板间差异。在每块板上均应设立对比孔，尤其是每板都应设阴性对比。 .切忌加底物前将反应板暴露于空气中时间过长，不行将很多板一次甩干后再依此加 入底物。 【方法评价】 本法一般用于定量检测细胞培育上清液标本中IL-2的含量，其敏感性和特异性均较高, 缺点是操作步骤较多，简洁受到抗体浓度、抗体对包被固相的吸附力量及酶标抗体质量的影 响，因此应在充分预试验的基础上，确定各抗体的最佳稀释度，以达到最佳检测效果。本方 法亦可用于标本