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DNA芯片技术诊断HBV YMDD变异 Detection of YMDD Motif Mutants by Oligonucleotide Chips in Lamivudine-Untreated Patients with Chronic Hepatitis B Virus Infection。J Korean Med Sci 2004; 19: 541-546. 第三十页，共五十九页。 DNA芯片技术 优点 局限性 大通量 技术和设备的要求高 快速 检测成本高 灵敏度高 可平行检测 第三十一页，共五十九页。 实时荧光定量PCR在基因变异中的应用 探针定点突变PCR技术Taqman-MGB探针 引物末端碱基定点突变扩增技术 高分辨熔解曲线法 第三十二页，共五十九页。 Taqman-MGB探针定点突变PCR技术 第三十三页，共五十九页。 Taqman-MGB探针技术检测YMDD变异 HBV DNA105copies/ml W:M=1:1 HBV DNA105copies/ml W:M=10:1 HBV DNA105copies/ml W:M=10:1 ：W ：M 第三十四页，共五十九页。 探针定点突变PCR技术 优点 不足 灵敏度高 需要相对较贵的荧光PCR仪 特异性好 需要多条荧光探针，成本高 费时短 影响因素多，存在一定误判 第三十五页，共五十九页。 引物末端碱基定点突变扩增技术 第三十六页，共五十九页。 引物末端碱基定点突变扩增技术检测YMDD变异 第三十七页，共五十九页。 熔解曲线法检测YMDD变异 特异性探针，其Tm值不同 溶解曲线分析 第三十八页，共五十九页。 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)原理 第三十九页，共五十九页。 MALDI-TOF MS检测HBV YMDD变异的原理 酶切分子量.JPG 第四十页，共五十九页。 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALD I-TOF MS) 优点： 高灵敏度、准确度、分辨率 能发现相对比例小于1%的变异株。 局限性： 设备昂贵，目前国内难以用于临床检测。 第四十一页，共五十九页。 HBV耐药不同检测技术的比较 Advances in Molecular Diagnosis of HBV Infection and Drug Resistance。Int. J. Med. Sci. 2005 2(1)：8-16 1Sensitivity here refers to the lowest level (%) at which an assay can detect mixtures of mutant and wild-type virus. 2Information content is considered as a measure of a test’s ability to provide broad, relevant information about possible new mutations. 3Updateability assesses the ease at which a test can be dapted to incorporate the detection of a new mutation. na, not applicable. nd, not determined. 第四十二页，共五十九页。 HBV表型耐药检测 有两种途径： 1.细胞外HBV聚合酶活性分析。 2.细胞药物敏感性实验。 第四十三页，共五十九页。 细胞外HBV聚合酶活性分析 目前常用的研究HBV聚合酶活性模型是将HBV基因组插入杆状病毒载体，继而转染昆虫细胞而表达HBV颗粒，应用亲和层析法纯化HBV颗粒后，在细胞外评价药物对聚合酶活性的影响。 第四十四页，共五十九页。 细胞外HBV聚合酶活性分析 第四十五页，共五十九页。 细胞药物敏感性实验 该方法类似于细菌药物敏感试验。目前多采用病毒载体将含有被检测的含HBV变异位点的全基因组导入肝细胞源性细胞株，然后将各种浓度的核苷类药物加入培养液，经过一定时间培养后检测细胞上清中的HBV DNA含量。 第四十六页，共五十九页。 细胞药物敏感性实验 第四十七页，共五十九页。 缪晓辉 2009.5 第一页，共五十九页。 一、HBV耐药的有关定义 二、各种耐药检测技术的评价 三、需要重视的几