鹅痛风病毒抗原蛋白原核表达载体的构建.docx

PAGE 8 PAGE 8 题 目：鹅痛风病毒抗原蛋白原核表达载体的构建 目 录 摘要 (1) 引言(1) 材料与方法(2) 材料(2) 菌种与质粒(2) 常用培养基及试剂(2) 主要仪器及设备(2) 方法(2) 引物设计与合成(2) 基因组RNA的提取与反转录(2) 目的DNA片段的PCR扩增(2) 目的基因与pET-43.1a质粒的双酶酶切(3) 重组表达载体的构建与鉴定(3) 结果与分析(5) ORF2基因片段的扩增(5) 目的DNA与pET-43.1a质粒的双酶切(6) 重组表达质粒的菌液PCR鉴定(6) 重组表达质粒的双酶切鉴定(6) 讨论(7) 4　小结(8) 参 考 文 献(8) Abstract(10) 鹅痛风病毒抗原蛋白原核表达载体的构建 　　摘要:为了构建新型鹅痛风病毒抗原蛋白原核表达载体，本项研究将新型鹅痛风病毒的ORF2基因序列通过RT-PCR 进行扩增，随后连接入表达质粒载体pET-43.1a，将连接后的载体pET43.1a-ORF2转化入DH5α感受态细胞，通过PCR 鉴定，Xho Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切鉴定；结果表明鹅痛风病毒抗原蛋白原核表达载体的构建成功，为制备新型鹅痛风病毒重组蛋白疫苗奠定基础。 关键词：原核表达载体；痛风病毒；抗原蛋白；PCR 0 引言 　　自2017年以来，雏鹅传染性痛风疾病逐渐在全国蔓延，给我国养鹅业带来了巨大的经济损失，严重威胁了我国养鹅业的发展。雏鹅传染性痛风病主要感染3周龄以内的雏鹅，发病率高，死亡率达50%。经病原分离鉴定及动物回归试验，证明新型鹅星状病毒为引起雏鹅痛风病的主要致病病原[1]。当前对于该病尚无有效的治疗措施。雏鹅痛风 病采用常规的抗菌、抗病毒治疗方法均没有明显的效果，故急需相关疫苗的开发研制。本项研究将根据载体质粒 pET-43.1a图谱和目的基因DNA设计一对特异性引物，扩增雏鹅痛风病毒的抗原基因并利用pET-43.1a质粒构建新型鹅痛风病毒抗原蛋白原核表达载体，为制备新型鹅痛风病毒重组蛋白疫苗奠定基础，以期为鹅痛风型星状病毒感染所引起的鹅痛风治疗提供一定的理论技术基础。 　　姜晓宁、张清水等对患病鹅病理样品进行了相关的检测、病原分离鉴定和动物回归试验，确定导致雏鹅痛风的病原为新型星状病毒，该研究为雏鹅痛风的防控提供了方向[2]。金美玲，冯崇伦等通过对雏鹅痛风病例样品进行了一系列的研究，发现了一种新的鹅星状病毒[3]。鹅痛风的临床表现为排泄物白色、小腿关节肿大，尿酸沉积及瘫痪。在动物尸检中，胆囊、膝盖和输尿管以及心脏、心脏、肝脏、气囊、气管和前胃表面都有肾脏肿大和尿酸盐沉积[4-7]。根据已有的研究对雏鹅痛风临床表现的描述，本人所在的团队已经收集了较多的来自南阳及其周边地区不同鹅场的病、死鹅样品，而且已经初步经过RT-PCR检测并筛选出鹅痛风阳性样品。在前期的准备工作中，本人所在的团队已经从筛选的鹅痛风阳性样品中获得并测序鉴定了一株鹅星状病毒毒株，已经将该株毒株的ORF2基因扩增和测序，为构建鹅痛风病毒抗原蛋原核表达载体的研究做好了前期的准备工作。 材料与方法 材料 菌种与质粒基因工程宿主菌DH5α，T载体pMD18-T，表达载体为pET-43.1a。 常用培养基及试剂 　　LB液体培养基;LB固体培养基;LA固体培养基（含氨苄青霉素100 μg/mL）;T4 DNA连接酶及相应缓冲液;质粒DNA 抽提试剂盒;DNA凝胶回收试剂盒( Easy Pure GeL DNA Extraction Mini kit) ；10 × K Buffer；10 × M Buffer （PCR扩增缓冲液）；DNA 聚合酶；Xho I酶和BamH I酶。 主要仪器及设备 　　PCR Express Gradient PCR仪；BIO-RAD凝胶成像及分析系统；冷冻高速离心机；超低温冰箱；37℃恒温摇床； DYY-6B型稳压稳流电泳仪（北京六一仪器厂）；医用超净工作台；恒温培养箱；恒温水浴锅；移液枪；无菌EP管；紫外透射分析仪。 方法 引物设计与合成 　　根据目的基因ORF2的基因序列和原核表达载体pET-43.1a质粒的图谱设计了如下1对特异性引物：上游引物 TGTGGATCCatggcagacagggcggtggccccg,下游引物GTGCTCGAGctcatgtccgcccttctcaaAGC，扩增片段长度为2120 bp。 基因组RNA的提取与反转录依据基因组RNA试剂盒的操作步骤进行基因组RNA的提取，并进行反转录得到cDNA。 目的DNA片段的PCR扩增 　　采用20 μL体系进行目的DNA的PCR扩增。扩增体系如下:毒株cDNA: 0.5 μL;引物: 0.3 μL；GC: 0.2 μL; dNTPs: 1 μL; buffer