实验中常用蛋白检测方法.pptxVIP

会计学;Western Blot;Western Blot;原理：抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究。 特点：是融合了免疫学原理（抗原抗体特异性结合）和组织学技术（组织的取材、固定、包埋、切片、脱蜡、水化等），通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色，来对组织（细胞）内抗原进行定位、定性及定量的研究(主要是定位)。样本是细胞或组织，要在显微镜下观察结果，可能出现膜阳性、质阳性和核阳性。 ;原理：酶联免疫法，它的中心就是让抗体与酶复合物结合，然后通过显色来检测。 特点：免疫学原理和化学反应显色，待测的样品多是血清、血浆、尿液、细胞或组织培养上清液，需将抗原或抗体结合到固相载??表面，从而使后来形成的抗原-抗体-酶-底物复合物粘附在载体上，这就是“吸附”的含义。;蛋白检测方式;蛋白的交互作用;寻找目标蛋白;验证两蛋白间作用;验证蛋白交互作用方法;CO-IP，又叫免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation） 其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Z也能沉淀下来。 目前多用proreinA预先结合固化在琼脂糖微珠上，Protein A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，能特异性地与人和哺乳动物抗体的Fc区结合，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，琼脂糖微珠上的proreinA/G与抗体Fc特异性结合，由于抗体抗原特异性，沉淀蛋白X；溶液中有和蛋白X相互作用的物质，就能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。;;Pull-down实验;研究某分子A在椎间盘退变中作用 椎间盘标本 切片，HE，特殊染色 免疫组化 基质、退变酶、目的蛋白 WB 细胞 常规蛋白 WB，免疫荧光 分泌蛋白 ELISA 蛋白分子多 ELISA 动物实验 免疫组化/免疫荧光