h蛋白质工程简介.pptxVIP

h蛋白质工程简介会计学第一节 蛋白质工程简介第1页/共15页蛋白质工程这一名称最早是1981年由美国基因公司的Ulmer提出的。目前，蛋白质工程主要集中在改造现有的蛋白质。蛋白质工程就是为了生产出符合人类生产和生活需要的蛋白质，甚至是自然界不存在的蛋白质。第2页/共15页 蛋白质的功能是DNA决定的，那么要制造出新的蛋白质，就要改造DNA，所以蛋白质工程的原理应该是中心法则的逆推。第3页/共15页蛋白质工程的基本原理DNA合成分子设计预期功能基因DNA氨基酸序列多肽链蛋白质三维结构生物功能mRNA折叠转录翻译蛋白质工程简介第4页/共15页一、蛋白质工程的主要步骤二、蛋白质分子设计的主要依据三、经验性规律蛋白质工程的主要步骤通常包括：第5页/共15页 1 分：从生物体中分离纯化目的蛋白；2 测：测定其氨基酸序列；借助核磁共振和X射线晶体衍射等手段 尽可能地了解蛋白质的二维重组和三维晶体结构;3钓：设计引物或探针，从文库中获取编码该蛋白质的基因序列4设：设计改造方案 设计各种处理条件，了解蛋白质的结构变化，包括折叠与 去折叠等对其活性与功能的影响； 设计编码该蛋白的基因改造方案，如点突变；5改：对基因序列改造6表：通过基因工程表达7检：分离、纯化新蛋白，功能检测后投入实际使用。第6页/共15页蛋白质分子设计的主要依据来自三方面关系的知识： ①蛋白质分子间的进化关系:通过同源蛋白质序列的微观差异可找出对空间结构和生物功能的影响；另一方面蛋白质的进化研究也为蛋白质的构造规则提供了信息。 ②蛋白质一级结构与空间结构的关系，由此可以通过一级结构预测高级结构。 ③蛋白质结构与功能的关系，找出结构改变对功能的影响。第7页/共15页蛋白质工程的经验性规律：1. 注意保留脯氨酸、半胱氨酸残基疏水性氨基酸常常出现在蛋白质的活性中心区域；α螺旋和β折叠区通常不会是酶的活性中心或配体、底物的结合中心，而是作为结构的支架；环区、转角区域和带电荷区域通常位于蛋白质的表面，在底物结合区和配基结合区。 设计突变时要注意保留脯氨酸．半胱氨酸残基． 因为脯氨酸常被用来终止α螺旋区 ，而半胱氨酸常形成起稳定作用的二硫键，同时二硫键又是许多分泌性蛋白的标志。2.保留保守残基蛋白质工程的经验性规律：第8页/共15页进行点突变时要注意保守氨基酸残基，如果要改变酶活性，底物结合活性等高度特异性的性质，则应尽量保留保守残基。第9页/共15页蛋白质工程的经验性规律：3.保留潜在的N糖基化位点应注意保留潜在的 N糖基化位点(Asn—X—Ser／Thr—X—Pro)中的Asn、Ser 或Thr。 在很多情况下，特别是分泌性蛋白和穿膜蛋白，能否正确糖基化对蛋白质活性的影响很大。第10页/共15页蛋白质工程的经验性规律：4.可删除某一外显子含有内含子的序列，可删除某一外显子或外显子组合，因为单个外显子通常编码独立折叠的结构域，删去该结构域后可能不会影响蛋白质其余部分的正确折叠。5.构建嵌合体蛋白质工程的经验性规律：第11页/共15页同源蛋白嵌合体：应尽量使其接合部位落在具有相同或相近功能的氨基酸序列中。非同源蛋白嵌合体：接合部位应尽量位于所预测结构的边缘。6.鉴定功能性结构域蛋白质工程的经验性规律：第12页/共15页目的蛋白的三维结构一无所知，在目的基因序列中随机插入六聚体接头以鉴定功能性结构域，插入六繁体接头后，在原蛋白质序列中添加了两个氨基酸，这比插入更多的氨基酸对白蛋质整体功能的破坏要轻。第13页/共15页蛋白质工程的经验性规律：7.避免直接利用天然存在的限制性 酶切位点进行基因删除进行缺失突变时，应避免直接利用天然存在的限制性酶切位点进行删除。如果直接利用这种限制性内切酶位点，很容易破坏正确的ORF，或得到的缺失突变体边界不能落在适当的位置，而使蛋白质不能正确折叠。思考题第14页/共15页1、蛋白质工程的基本原理。2、蛋白质工程的主要步骤是什么？3、蛋白质分子设计的主要依据哪些？4、简述到目前为止在蛋白质改造中所积 累的经验性规律。