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会计学1RTPCR反转录原理及方法 背景基因的表达基因组DNA (genomic DNA)信使RNA (messenger RNA, mRNA)蛋白质产物不同细胞或组织表达不同的基因第1页/共20页 目的通过反转录(reverse transcription，RT)和聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)的方法，检测目的基因在特定组织或细胞中、mRNA水平的表达丰度。第2页/共20页 原理及方法mRNA (messenger RNA)cDNA (complementary DNA) PCR产物RT(反转录) PCR(聚合酶链反应)第3页/共20页 原理及方法第4页/共20页 第5页/共20页 步骤1--提取总RNATRIzol法抽提总RNA 1、细胞1×107 或组织100mg,加1mlTRIzol (细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块匀浆要彻底，后转至EP管） 颠倒混匀10下，室温5分钟。 2、氯仿1/5体积（），颠倒混匀10下，室温5分钟。 3、4℃，离心12000g，15分钟。 4、转上层水相（约400μl）于另一管中，加等体积异丙醇（约400μl），混匀室温10分钟。 5、4℃，离心12000g，10分钟。 6、弃上清，加冰预冷的75%乙醇（用DEPC水配）1ml。 7、4℃离心7500g，5分钟。 8、弃上清，空气干燥5-10分钟（不能完全干燥），溶于DEPC水中至20μl（可在55-60℃水中，10分钟助溶）。 9、紫外分光光度计测总RNA浓度。 第6页/共20页 步骤2—反转录(RT)逆转录反应： 1、试剂 浓度 体积 终浓度 RNA 23μl(11.5μl) Oligo(dT)15 0.05μg/μl 4μl(2μl) 0.005μg/μl 混匀，离心，70℃ 5min。 2、立即冰水浴，稍离心 试剂 浓度 体积 终浓度 M-MLV Buffer 5× 8μl (4μl) 1× dNTP 10mM 2μl (1μl) 0.5mM RNasin 40U/μl 1μl (0.5μl) 20μ M-MLV 200U/μl 2μl (1μl) 200U 总体积40μl（20μl）混匀，离心，42℃ 60-90min。 3、95℃ 10min（破坏MLV），4℃保存。 第7页/共20页 步骤3—聚合酶链反应(PCR)PCR反应： 反应体系：总体积20μl(50μl)  试剂 浓度 体积 终浓度 Taq Buffer 10× 2μl (5μl_) 1× dNTP 10mM 0.2μl (0.5μl) 200uM 上游引物 10pmol/μl 0.3μl (1μl) 10pmol 下游引物 10pmol/μl 0.3μl (1μl) 10pmol cDNA模板 (1-10μl) Taq酶 2.5U/μl 0.3μl (1μl) 2.5U/μl DEPC水 20μl-4.3μl混匀 反应条件： 95℃ 5分 预变性  94℃ 30秒 变性  X℃ 40秒 退火  72℃ 30秒 延伸  72℃ 7分 终末延伸  28-36循环，4℃保温 第8页/共20页 步骤4—琼脂糖凝胶电泳加1-10μl PCR产物与上样缓冲液（）混匀，加样，电泳。第9页/共20页 所需材料及试剂一、实验器具与材料： 1、移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl 2、吸头：1ml、200μl、20μl 3、匀浆管：5ml 4、吸头台：放置1ml吸头的一个，放置20μl吸头的一个 5、EP管：、、100μl 6、试剂瓶：2个60ml的棕色试剂瓶（广口，带盖） 1个125ml的白色试剂瓶（放无水乙醇） 7、量筒：50ml、250ml、500ml 8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml 9、试管架：5ml、、20μl 10、盐水瓶：250ml、500ml各2个备用，一个装无水乙醇，另一个装DEPC水 11、铝制饭盒：4个 12、塑料小饭盒：1个 13、大瓷缸：2个 14、锡泊纸