牛病毒性腹泻病毒实时荧光定量RTPCR方法的建立及应用.pdfVIP

牛病毒性腹泻病毒实时荧光定量 RT-PCR方法的建立及应用 王荣;李文文;王研;刘亚刚;余琼;任永刚 【摘要】持续性感染和免疫耐受是牛病毒性腹泻病的重要特征,这一特征给该病的 诊断、检疫及防控造成很大困难,为此,建立快速实用、高效敏感的牛病毒性腹泻病 毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)检测方法具有重要意义.据 GenBank 中登录 的 BVDV 5 UTR 保守区域设计并合成 1 对特异性引物,以 SYBR Green Ⅰ染料为 扩增指示剂,建立了 BVDV 实时荧光定量 RT-PCR 检测方法.结果表明,该方法具有 快速、敏感、特异、重复性好等优点.该方法的建立为牛病毒性腹泻病的早期快速 诊断和有效检出持续性感染动物提供了手段,是该病检疫和诊断方法的补充和完善. 【期刊名称】《中国畜牧兽医》 【年(卷),期】2014(041)002 【总页数】5 页(P35-39) 【关键词】牛病毒性腹泻病毒;实时荧光定量 RT-PCR;5UTR;检测方法 【作者】王荣;李文文;王研;刘亚刚;余琼;任永刚 【作者单位】西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都 610041;西南民族大学 生命科学与技术学院,四川成都 610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成 都 610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都 610041;西昌市畜牧局,四 川西昌 615000;西昌市畜牧局,四川西昌 615000 【正文语种】中 文 【中图分类】S852.65+9.6 牛病毒性腹泻病 毒（bovine viral diarrhea virus ，BVDV ）与羊边界病病毒 （border disease virus ，BDV ）、猪瘟病毒（classical swine fever virus ， CSFV ）同属于黄病毒科（Flaviviridae ）瘟病毒属（Pestivirus ）（John 等， 2000 ），主要感染牛，引起传染性牛病毒性腹泻病，是危害养牛业的主要传染病 之一。BVDV 能突破宿主特异性发生交叉感染（Baxi 等，2006 ；Young 等， 2006 ），易感动物除牛外，还包括绵羊、山羊、猪、鹿等（张会敏等，2009 ）， 不利于有效预防本病的发生和传播（Vilcek 等，2001 ）。牛病毒性腹泻病临床症 状主要表现为腹泻、黏膜病（MD ）、血小板减少、呼吸综合征、母畜流产、死胎 和畸形胎、免疫耐受和持续性感染（PI ）等。出现免疫耐受和持续性感染是该病区 别于其他疾病的一个重要特征，这一特征是导致 BVDV 感染动物长期带毒排毒、 不易检出的重要原因之一，给该病的防控造成很大困难。目前，国内外检测、诊断 BVDV 的方法很多，常用的检测方法有病毒分离培养、中和试验、酶联免疫吸附试 验、RT-PCR 等，存在费时费力、准确性不高、非特异性反应或敏感性低等缺点 （高存福等，2007 ）。常规RT-PCR 检测虽然提高了诊断的特异性，但敏感性不 足、只能进行半定量或定性分析、在进行大量样品检测时易污染。因此建立一种特 异、简便、高效、高通量的检测方法，对促进中国的养殖业健康发展、减少因该病 引起的经济损失有重要意义。 实时荧光定量 RT-PCR 技术是在 PCR 技术的基础上发展起来的，具有灵敏度高、 重复性好、高通量性、省时省力等优点；可通过引物设计、序列测定等方法对病原 进行鉴别分析，现已成为 BVDV 检测的首选方法（Saliki 等，2000 ）。本试验以 SYBR GreenⅠ染料为信号指示剂，建立了 BVDV 实时荧光定量 RT-PCR 检测体系， 为牛病毒性腹泻病防控提供有效的检测依据。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 毒株、细胞系及样品 BVDV 牦牛 Yak 株、标准株 OregonC24V 均购自中国 兽医药品监察所；牛肾细胞系（MDBK ）购自中科院上海细胞库；47 份牦牛血清 样品分别采自松藩、汶川及红原地区健康牦牛。 1.1.2 主要试剂 JM109 感受态细胞由西南民族大学动物医学实验室制备保存； pMD19-T 载体、XGal、Amp、IPTG、Ex Taq 聚合酶、DL2000DNA Marker 及 Prime Script RT reagent Kit 均购自宝生物工程（大连）有限公司；细胞培养瓶、 DMEM 培养液、小牛血清、96 孔板及 Trizol 试剂盒均购自上海英骏生物科技有 限公司；DNA 凝胶回收试剂盒、质粒 DNA 小量试剂盒均购自天根生化科技有限 公司；其他常规试剂均为国产