实验一RNA提取方法及原理.pptxVIP

实验一RNA提取方法及原理会计学第1页/共28页一、研究背景二、方法及原理一、研究背景第2页/共28页1. RNA研究的重要性 DNA，RNA和蛋白质是三种重要的生物大分子，是生命现象的分子基础。 DNA的遗传信息决定生命的主要性状，而mRNA在信息传递中起很重要的作用。其它两大类RNA，rRNA和tRNA，同样在蛋白质的生物合成中发挥不可替代的重要功能。因此mRNA、rRNA、tRNA在遗传信息由DNA传递到表现生命性状的蛋白质的过程中举足轻重。 第3页/共28页不同丰度组织名称样品量总RNA含量高丰度肝脏1mg2-4μg脾脏1mg心脏1mg中丰度大脑1mg0.05-2μg胚胎1mg肾脏1mg肺1mg低丰度膀胱1mg0-0.05μg骨1mg脂肪1mg高丰度成纤细胞1050.5-1μg人白细胞105中丰度酵母1050.5-1.5μg拟南芥叶片1mg0.2-0.5μg低丰度烟草叶片1mg0.05-0.1μg玉米叶片1mg2 RNA分布二、方法及原理第4页/共28页1 、 RNA的提取流程 （1）样本前处理 （2）细胞裂解 （3） RNA的纯化及获得RNA提取流程－－ 样品前处理注意点第5页/共28页 选择新鲜血液，不得超过4小时选择新鲜组织，生长旺盛的组织选择新鲜的幼嫩组织选择处于生长旺盛的时期收集细胞第6页/共28页RNA提取流程－－ 样品前处理中如何保存样本可将新鲜血液先进行红细胞裂解，得到的白细胞然后加入一定量的TRNzol，-70℃保存较长时间推荐使用专门的RNA样品储存液进行储存液氮或加入RNase抑制剂中保存，避免反复冻融去掉培养基，加入一定量TRNzol-70 ℃保存较长时间异硫氰酸胍/酚－TRNzol总RNA提取试剂独特配方--RNAplant植物RNA提取试剂胍盐/β-巯基乙醇—RNAprep系列RNA提取试剂盒RNA提取流程－－细胞裂解，以释放RNA第7页/共28页RNA提取流程－－ RNA的纯化及获得第8页/共28页RNA纯化要求1 纯化后不应存在对酶(如逆转录酶)有抑制作用物质2 排除有机溶剂和金属离子的污染3 蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降低到最低程度4 排除DNA分子的污染第9页/共28页2. RNA提取的注意事项杜绝外源酶的污染a.严格戴好口罩，手套。 b.实验所涉及的离心管，Tip 头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要彻底处理。 c.实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保 RNase-Free。 第10页/共28页 阻止内源酶的活性 a.选择合适的匀浆方法。 b.选择合适的裂解液。 c.控制好样品的起始量。 第11页/共28页明确自己的抽提目的 a.任何裂解液系统在接近样品最大起始量时，抽提成功率急剧下降。 抽提成功的唯一经济的标准是后续实验的一次成功，而不是得率。 第12页/共28页Rnase 污染的10大来源 1：手指头2：枪头3：水/缓冲液 4：实验台面 5：内源 Rnase 6：RNA 样品7：质粒抽提 8：RNA 保存 9：阳离子 (Ca, Mg) 10：后续实验所用的酶 第13页/共28页复习核酸的提取方法RNA的提取苯酚水溶液提取细胞破碎 → 匀浆等体积90％苯酚水溶液振荡→RNA、Pro分开→RNA、多糖（水层）； DNA、Pro（苯酚层）冷酚法、热酚法，注意苯酚除杂复习核酸的提取方法第14页/共28页 DNA提取浓盐法：1mol/L氯化钠溶液提取，＋含少量辛醇或戊醇的氯仿一起振荡除去蛋白质 或：先用稀盐除去RNA－Pro，再用浓盐提取也可用苯酚法，苯酚层得到 DNA、Pro 复习核酸的提取方法第15页/共28页核酸的沉淀DNA的等电点，RNA的等电点2-2.5.收集上面的的水样层后，RNA 可以通过异丙醇沉淀。在除去水样层后，样品中的DNA 和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。 Trizol?试剂提RNA的原理第16页/共28页Trizol?试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂 。Trizol中含苯酚和异硫氰酸胍，可保护RNA免受RNase的污染。 Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，裂解细胞并释放出RNA,酸性条件使RNA与DNA分离,加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。第17页/共28页 TRIzol法提取流程1. 样品处理： 组织：取 100mg 组织（新鲜或 -70 ℃ 及液氮中保存的组织均可）置匀浆器中