动物细胞培养的基本技术.pptxVIP

细胞培养基本技术第1页，共42页。无菌操作技术 体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。即便使用设备完善的实验室，若实验者粗心大意，技术操作不规范,也会导致污染。因而,为在一切操作中最大可能地保证无菌，每一项工作都必须做到有条不紊和完全可靠。 第2页，共42页。Terms to remember :消毒(disinfection)和消毒剂(disinfectant)灭菌(sterilization)防腐(antisepsis)和防腐剂抑菌(bacteriostasis)和抑菌剂(bacteriostatic)无菌(asepsis)无菌技术/无菌操作(antiseptic technique)第3页，共42页。【培养前准备】 在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。这可以避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。第4页，共42页。【操作野消毒】 无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面—次(拖布要专用)，紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗。然后紫外线消毒30min。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线，消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线降低消毒效果。—些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。第5页，共42页。【洗手和着装】 原则上和外科手术相同。平时仅做观察不做培养操作时，可穿着细胞培养室内紫外线照射30min的清洁工作服。在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用75％酒精消毒手。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。 第6页，共42页。【火焰消毒】 在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，如按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。 第7页，共42页。【操作】 进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。 第8页，共42页。培养细胞的观察１．肉眼观察培养物颜色及混浊度２．倒置显微镜观察细胞生长状态第9页，共42页。第10页，共42页。细胞计数培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。血细胞计数器：手工计数细胞Coulter计数仪：人工计数第11页，共42页。细胞计数：　1、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。　2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。　3、静置3分钟。　4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：　细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×10000　注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。第12页，共42页。第13页，共42页。细胞传代方法根据细胞生长的恃点，传代方法有3种：1．悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。2．半悬浮生长细胞传代（Hela细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3．贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。第14页，共42页。贴壁生长细胞传代方法：1 吸光培养瓶中的培养液2 加入1-2 ml 0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）　静置2-10 min（显微镜下动态监测）。3 吸去胰蛋白酶液，加入培养液。4 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。5 离心，细胞沉淀用培养液制成悬液。5 吸取1/10—1/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内。6 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。7 将后者放入培养箱中培养。第15页，共42页。培养细胞活力测定任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。