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会计学1第章基因工程 2一、自然界的基因转移和重组：接合作用，转化、转导作用，噬菌体DNA的整合, 细菌的特异位点重组，转座重组，同源重组，插入序列的结构特点，转座子的结构特点。二、重组DNA技术 相关概念： 克隆，基因工程,工具酶,目的基因,基因载体 基本原理和过程： 目的基因的获取,克隆载体的选择和构建,外源基因与载体的连接,重组DNA的导入,重组体的筛选,克隆基因的表达。主要内容第1页/共81页 3第一节 细菌的基因转移和重组Bacterial Gene Transfer and Recombination.接合作用（conjugation） 当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA就可从一个细胞（细菌）转移到另一个细胞（细菌），这种类型的DNA转移称为接合作用。质粒 —细菌染色体外的小型环状双链DNA分子一、细菌的基因转移第2页/共81页 4F factor: 含有细菌性鞭毛蛋白的编码基因.F-F+F+F+F+F-接合转移F+第3页/共81页 5 通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用。 例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。溶菌摄取重组第4页/共81页 6溶菌生长途径(lysis pathway)： 噬菌体感染宿主时，噬菌体DNA在宿主内迅速增殖，产生新的病毒颗粒，溶解细菌，释放出新生噬菌体。 溶源菌生长途径(lysogenic pathway)： 噬菌体感染宿主时，噬菌体DNA整合进宿主染色上，随宿主复制而复制。 当遇到DNA损伤时，噬菌体（原噬菌体）从宿主菌（溶原菌）染色体上脱下来，进入溶菌生长途径。溶菌感染重组溶菌细菌噬菌体转导作用（transduction）第5页/共81页 73. 转导作用（transduction） 当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用。感染感染重组溶菌细菌第6页/共81页 8二、 DNA重组 ( DNA recombination)同源重组 (homologous recombination)特异位点重组 (site-specific recombination)定义：不同DNA分子间发生的共价连接或DNA分子内较大片段的交换称为重组或重排。转座重组 (transposition recombination) 自然界的基因转移和重组第7页/共81页 9发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombination)，它通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换，又称为基本重组。 是最基本的DNA重组方式:以的同源重组为例，了解同源重组机制。（一）同源重组第8页/共81页 10 内切酶 (RecBCD)DNA侵扰(RecA)分支迁移 (RecA) 内切酶(RecBCD) DNA 连接酶5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′3′3′5′3′5′3′3′5′5′3′5′3′5′3′Holiday中间体5′3′5′3′5′3′5′3′第9页/共81页 11Holiday中间体5′3′5′5′5′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′内切酶(RuvC)内切酶(RuvC) DNA连接酶 DNA连接酶片段重组体拼接重组体5′3′5′3′5′3′5′3′ABCDC5′5′5′5′3′3′3′3′ABD5′5′5′5′3′3′3′3′ACBD第10页/共81页 12同源重组关键步骤 ① 同源联会的两个DNA分子的任意一个DNA出现单链切口；② 两个单链对接，形成半交叉；③ 半交叉分支移动(branch migration)产生异源双链DNA；④ 形成Holliday中间体，Holliday中间体的变构和拆分。片段重组体(patch recombinant) 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。拼接重组体(splice recombinant) 切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。 第11页/共81页 13（二）位点特异重组位点特异重组(site-specific recombination) 是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。整合酶(intergrase, Int)： 是λ噬菌体DNA编码的产物，是一种DNA结合蛋白，对噬菌体的的重组位点a