分子生物学载体.pptVIP

第四章 基因工程载体; 载体 （Vectors） 在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。 载体是DNA双链分子。 载体DNA分子中是有一段生长扩增的非必需区，该区经人工改造后可插入外源的DNA，并可转入宿主细胞中，使外源DNA与载体DNA共同扩增。 ;载体的功能;理想载体至少必备的条件;目前的主要载体;分子生物学载体;大肠杆菌的质粒; 独立于染色体以外的能自主复制、并能被稳定遗 传的一类双链闭合环状DNA分子。 存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。 分子量： 1--300 kb。 编码基因少： 2—3个中等大小的蛋白质。如： 抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌一些额外的 特性（非必须）。 环形状：双链环状DNA。 ;质粒DNA的空间构型;? 质粒空间构型与电泳速率 分子量相同的，scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最 慢。;1.1 质粒的生物学基本特性;2. 生物不相容性（ Incompatibility ） 有时不同的质粒可同时共存在于一个细菌内，但 同群质粒（不同的，但亲缘性高）不能共存于同 一细胞，这种现象称为质粒的不相容性。 同群质粒含有相似复制子结构的不同质粒。 以大肠杆菌的质粒为例： ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容;质粒的不相容性分子机制;3.可转移性 部分质粒含有tra基因，指令宿主细胞产生菌毛，合成细胞表面物质，促使宿主细胞与受体细胞接合，导致遗传物质从一细胞转移至另一细胞中。 4.稳定性 质粒在宿主细胞中保持着一定的拷贝数。 5.寄生性 质粒只能在宿主的细胞内复制。 6.可扩增性;7. 携带特殊的遗传标记 野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括： 物质抗性：重金属离子、毒性阴离子、有机物 物质合成：抗生素、细菌毒素、有机碱等。 这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义。;1.2 质粒的类型;1.2 质粒的类型;1.3 质粒的命名;? 天然质粒的局限性 （1）分子量大，拷贝数低，单一酶切位点少 （2）筛选标志不理想 ? 质粒载体必须具备的基本条件 （1）具有复制起点（ORI） （2）具有抗菌素抗性基因——是筛选的标志 理想的载体应该有两种抗菌素抗性基因。 （3）若干限制性内切酶的单一位点：用来插入外源DNA片 段，且插入后不影响复制功能。 （4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。 （5）易从宿主细胞中分离纯化。;加入合适的选择标记基因，通常是抗生素基因。 增加或减少合适的酶切位点，便于重组。 缩短长度，切去不必要的片段，增加装载量。 改变复制子，由严紧变为松弛型，以增加拷贝数。 加装特殊的基因元件。 目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的： pSC101 8.8 kb 拷贝数 5 四环素抗性标记基因 Tcr ColE1 6.5 kb 拷贝数 20 - 30 大肠杆菌内毒素标记基因 E1 RSF2124 ColE1衍生质粒 氨苄青霉素抗性标记基因 Apr;? 人工构建的质粒载体的类型 （1）高拷贝数的质粒载体 适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的基因产 物。 （2）低拷贝数的质粒载体 不适合大量扩增DNA用。 但有特殊用途。 （3）温控的质粒载体（runaway plasmid vectors） 这是一类温度敏感型复制控制质粒。 温度低（低于37 ℃），拷贝数很少； 温度增加（40 ℃）时，拷贝数会很快增加到 1000个以上。;（4） 插入失活型质粒载体 载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。;（5）正选择的质粒载体（Direct selection vectors） 直接选择转化后的细胞。只有带有选择标记基因的转 化菌细胞才能在选择培养基上生长。目前通用的绝大部分 质粒载体都是正选择载体。 （6） 表达型质粒载体 主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。;;如何阅读质粒图谱;如何阅读质粒图谱;如何阅读质粒图谱;? University of California 的