毕赤酵母的基因表达及其初步纯化.pptxVIP

毕赤酵母的基因表达及其初步纯化会计学毕赤氏酵母作为表达载体的优点第1页/共29页1、表达效率高，遗传稳定性好2、结构简单，表达调控机理比较清楚3、有Pr加工系统4、培养简单，成本低廉5、表达产物可分泌至培养基中而自身蛋白的分泌却很少，利于下游的纯化（毕赤氏酵母是近年来广泛应用的真核表达系统。） 一、实验材料第2页/共29页 DH5α、pPICZαA 、GS115、TOP10、，pQE4Aβ15pMD18T载体、Pfu高保真酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶 . PCR产物纯化试剂盒、质粒提取试剂盒、羊抗鼠IgG -HRP、增强型HRP-DAB、底物显色试剂盒. 基因在毕赤氏酵母中表达的简单过程第3页/共29页4Aβ15基因的获取(PCR)↓目的基因的修饰与克隆↓表达载体的构建↓毕赤氏酵母的线性化、电转化与鉴定↓目的基因在毕赤酵母GS115中的表达↓重组蛋白的鉴定与分析↓重组 4A 15 的初步纯化1、目的基因4Aβ15获取PCR第4页/共29页在设计 N 端引物时引入XhoⅠ酶切位点及 Kex2 信号肽水解位点，并删除 Kex2后面的 Ste3 位点（Glu-Ala-Glu-Ala）在下游引物（5 GC TCT AGA TTG ATG ATG AACTTC ATA 3）引入终止密码子和XbaⅠ酶切位点，目的基因4Aβ15获取PCR第5页/共29页以 pQE4Aβ15 为模板，进行