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第八章 菌种的保藏 要点： 菌种的衰退：菌种衰退的现象可表现在形态上或生理上。其主要原因是基因突变，连续传代 和采用不适宜的培养和保藏条件也可加速菌种的衰退。为防止菌种衰退可采取一些措 施，如控制传代次数、创造良好的培养条件、利用不同类型的细胞移种传代、采用有 效的菌种保藏方法、讲究菌种选育技术及定期进行分离纯化等。 菌种的复壮：从已衰退的菌种中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的 方法是一种“狭义的复壮”，目前较提倡的是被称为“广义复壮”的一种积极措施， 即在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性 状测定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。菌种复壮常用方法有：纯种分离法、 宿主体内复壮法、淘汰法和遗传育种法。 菌种的保藏：菌种保藏的目的是尽可能保持菌种原有性状和活力的稳定，使其不死、不变、 不被污染，以提供给科研、生产和实验的需要。为防止突变，保持纯种，最主要的保 藏措施是干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养、添加保护剂等。保藏菌种的方法有： 斜面低温保藏法、石蜡油封藏法、砂土管保藏法、麸皮保藏法、甘油悬液保藏法、冷 冻真空干燥保藏法、液氮超低温保藏法和宿主保藏法等。 第一节 菌种的衰退和复壮 在微生物的基础研究和应用研究中，选育一株理想的菌株是一件艰苦的工作，而欲使菌种始终保持优良性状的遗传稳定性，便于长期使用，还需要做很多日常的工作。实际上，由于各种各样的原因，要使菌种永远不变是不可能的，菌种衰退是一种潜在的威胁。只有掌握了菌种衰退的某些规律，才能采取相应的措施，尽量减少菌种的衰退或使已衰退的菌种得以复壮。 一、菌种的衰退 （一）菌种衰退的现象 菌种衰退（degeneration）是指由于自发突变的结果，而使某物种原有的一系列生物学性状发生量变或质变的现象。菌种衰退的具体表现有以下几个方面： 1. 菌落和细胞形态改变。每一种微生物在一定的培养条件下都有一定的形态特征，如果典型的形态特征逐渐减少，就表现为衰退。例如，泾阳链霉菌“5406”的菌落原来为凸形变成了扇形、帽形或小山形；孢子丝由原来螺旋形变成波曲形或直形，孢子从椭圆形变成圆柱形等。 2. 生长速度缓慢，产孢子越来越少。例如，“5406”的菌苔变薄，生长缓慢(半个月以上才长出菌落)，不产生丰富的桔红色的孢子层，有时甚至只长些黄绿色的基内菌丝。 3. 代谢产物生产能力的下降，即出现负突变。例如，黑曲霉糖化力、放线菌抗生素发酵单位的下降以及各种发酵代谢产物量的减少等，在生产上是十分不利的。 4. 致病菌对宿主侵染能力下降。如白僵菌对宿主致病能力的降低等。 5. 对外界不良条件（包括低温、高温或噬菌体侵染等）抵抗能力的下降等。如抗噬菌体菌株变为敏感菌株等。 值得指出的是，有时培养条件的改变或杂菌污染等原因会造成菌种衰退的假象，因此在实践工作中一定要正确判断菌种是否退化，这样才能找出正确的解决办法。 （二）菌种衰退的原因 菌种衰退不是突然发生的，而是从量变到质变的逐步演变过程。开始时，在群体细胞中仅有个别细胞发生自发突变（一般均为负变），不会使群体菌株性能发生改变。经过连续传代，群体中的负变个体达到一定数量，发展成为优势群体，从而使整个群体表现为严重的衰退。经分析发现，导致这一现象的原因有以下几方面。 1. 基因突变 （1）有关基因发生负突变导致菌种衰退 菌种衰退的主要原因是有关基因的负突变。如果控制产量的基因发生负突变，则表现为产量下降；如果控制孢子生成的基因发生负突变，则产生孢子的能力下降。菌种在移种传代过程中会发生自发突变。虽然自发突变的几率很低(一般为10-6～10-9)，尤其是对于某一特定基因来说，突变频率更低。但是由于微生物具有极高的代谢繁殖能力，随着传代次数增加，衰退细胞的数目就会不断增加，在数量上逐渐占优势，最终成为一株衰退了的菌株。 （2）表型延迟造成菌种衰退 表型延迟现象也会造成菌种衰退。如，在诱变育种过程中，经常会发现某菌株初筛时产量较高，进行复筛时产量却下降了。 （3）质粒脱落导致菌种衰退 质粒脱落导致菌种衰退的情况在抗生素生产中较多，不少抗生素的合成是受质粒控制的。当菌株细胞由于自发突变或外界条件影响（如高温），致使控制产量的质粒脱落或者核内DNA和质粒复制不一致，即DNA复制速度超过质粒，经多次传代后，某些细胞中就不具有对产量起决定作用的质粒，这类细胞数量不断提高达到优势，则菌种表现为衰退。 2. 连续传代 连续传代是加速菌种衰退的一个重要原因。一方面，传代次数越多，发生自发突变（尤其是负突变）的几率越高；另一方面，传代次数越多，群体中个别的衰退型细胞数量增加并占据优势越快，致使群体表型出现衰退。 3. 不适宜的培养和保藏条件 不适宜的培养和保藏条件是加速菌种衰退的另一个重要原因。不良的培养条件如