SD大鼠肋软骨细胞的原代培养和去分化现象的观察(1).pdfVIP

SD 大鼠肋软骨细胞的原代培养和去分 化现象的观察 【摘要】 目的 建立大鼠肋软骨细胞(RCC)分离、培养的方法， 探讨其传代 过程中细胞外基质及其形态的变化。方法采用胰酶和 II 型胶原酶两步消化法结合 机械吹打获得分散的单个 RCC，观察单层培养的不同代数 RCC 的细胞形态变化;采 用免疫细胞化学方法检测不同代数 RCC 蛋白多糖和Ⅱ型胶原的表达。结果 大鼠肋 软骨经两步消化后，可获得高纯度的软骨细胞，经免疫组化及甲苯胺蓝染色呈阳性 结果，同时观察到 RCC 在传代过程中细胞发生了去分化现象。结论 软骨细胞可以 通过传代培养获得扩增，但仅限于四代以内细胞。 【关键词】大鼠;软骨细胞;单层培养;去分化 Abstract: Objective To establish the separating and culturing methods for rat costochondral chondrocyte (RCC)， and to investigate their morphous changes in the course of cell passage.Methods Under the help of collagenase II and trypsin s digestion， the scattered single RCC was obtained. The observation of morphological changes of RCC cells cultured by monolayer culture in different generations was carried out. And the detection of the expression of collagen II and proteoglycan of RCC cells in different generations by immunocytochemical method was also implemented. Results High purity cartilage cells were obtained from rat costal cartilages after digested by collagenase II and trypsin. It was confirmed by immunohistochemistry and toluidine blue staining. The dedifferentiation of RCC cells was observed when the RCC cells were cultured by monolayer culture.Conclusions RCC cells can be amplified by passage Culture，but only within the cells of four generations. Key words:rat; cartilage cell; monolayer culture; dedifferentiation 关节软骨损伤后，因局部血供缺乏，所以多年来一直被认为软骨细胞本身 不具有修复与再生能力。1989 年 Webber[1]的研究结果却显示:软骨细胞能进行自 我修复，只是它们的修复能力在体内环境中不能得到激发。 自20 世纪 80 年代以来，人们对关节软骨的再造和修复研究的焦点已转向 细胞疗法 (cell-based therapy )，即移植足够数量的软骨细胞来修复关节软骨的 缺损。Yanchun Liu 等[2]偿试应用自体关节软骨细胞为种子细胞，以聚轻基乙酸 (polyglycolic acid， PGA )及 Pluronic 为支架材料，对猪膝关节全厚软骨缺损 (直径 8 mm)进行修复，在 24 周时取得了最佳修复效果。修复的缺损表面光滑，与 周围正常软骨无法区分，新生软骨在组织学、生化组成上与正常关节软骨非常接 近，最大抗压能力达到了正常关节软骨的 60%以上。 本实验拟为软骨种子工程种子软骨细胞的优化获取提供一种有效的可行方 法，并探讨其分化能力及分化后的生物学性状。 1 材料与方法 1.1 材料 II 型胶原酶(Sigma公司)，胰蛋白酶(Hyclone公司)，标准胎 牛血