农杆菌的转化流程.docxVIP

农杆菌的转化流程方案一 农杆菌的培养及感受态的制备 ① 农杆菌菌株划 YM 平板，26-28℃培养 48 h； ② 挑取单菌落接种到 40 ml 无抗生素的 YM 液体培养基中，250 r/min， 26-28℃ 悬浮培养 12-16 h； ③ 将菌液转入灭过菌的 50 ml 离心管中，4℃，8000 r/min,离心 8 min； ④ 弃上清，加入用 100 mM NaCl (4℃预冷)重悬收集的农杆菌； ⑤ 4℃，8000 r/min, 离心 8 min； ⑥ 弃上清，加入原始菌液 1/50 体积（800? l/管（此时的感受态农杆菌可以直接用于转化）并分装成 100? l）的 20 mM CaCl2 重悬菌体； ⑦ 置液氮中 10 s，放入-20℃冰箱中保存备用。 农杆菌的转化（冻融法） 将感受态农杆菌置于冰上，加入 1?g 质粒 DNA（体积不宜超过 10 ? l），充分混匀，冰上放置 30 min； ② 置液氮中快速冷却约 1min 后迅速转入 37℃水浴中，待其融化； ③ 加 1 ml 无抗生素的 YM 液体培养基于 28℃，230 r/min 培养 2-4 h；（或直接用 1 ml?l，留 500 ? l 于管中④ 3000 r/min 离心 2 min 收集菌体，将上清吸去 500 培养菌直接涂布含抗生素的 YM 平板）； ⑤ 重悬菌体并涂布到含有适当抗生素的 YM 平板上吹干, 28℃培养 48 h； ⑥ 挑取单菌落接种到筛选液体 YM 培养基中，28℃，250 r/min 培养 48 h，将菌液用于保存或转化； 注：EHA105 抗利福平霉素，LBA4404 抗硫酸链霉素。在转化前后的所有培养基中均可加入相应的这两种抗生素，以防止杂菌污染。以上挑菌及抗生素加入工作均在超净台上进行。 转基因烟草体系的建立 ⑴ 烟草无菌苗的培养： ① 70%乙醇消毒烟草种子 30 s 后，用无菌水清洗两次，更换 NaClO 处理 25-30 min，无菌水清洗四次； ② 将灭菌后的种子移至 1/2 MS 固体培养基（大量元素、微量元素、CaCl2、FeSO4）、1.0 mg/L 维生素、2.0 mg/L 苷氨酸、3% 蔗糖、0.6-0.7% 琼脂（KOH 调至 pH 5.7-5.8），于 25-26℃，14 h 光照/10 h 黑暗条件下萌发； ③ 14 天后，将萌发出的烟草幼苗转移至含有相同1/2 MS 培养基的组织培养盒中， 同样条件下继续培养 4-6 周，小苗长出后可用于叶盘转化。 ⑵ 农杆菌介导的烟草叶盘转化和愈伤组织的筛选 于无菌条件下将无菌苗的成熟叶片除去叶边缘和主要叶脉，切成 0.5 cm 的小方块，浸泡在 MS 液体培养基悬浮的用于转化的农杆菌菌液中； ② 10 min 后取出叶片于灭菌的滤纸上吸去菌液，以叶片上表面接触培养基，8-9 片/培养皿，排列于倒有共培养基（MS（大量元素、微量元素、CaCl2、FeSO4）、 1.0 1℃光照培养箱中，14?mg/L 维生素、2.0 mg/L 甘氨酸、3% 蔗糖、0.6-0.7% 琼脂、pH 5.7-5.8）的平皿中，置于 24 h 光照/10 h 黑暗条件下共培养 48 h； ③ 1℃恒温摇床上振荡漂洗 45-60?当看到叶片与培养基接触边缘长出白色农杆菌时，将叶片转移至不加激素的 MS 液体培养基中，约 28 min，夹出叶片放于灭菌的滤纸上除去多余的液体培养基； ④ 将叶片上表面朝向培养基，8 片/皿排列于生芽筛选培养基（MS（大量元素、微量元素、CaCl2、FeSO4）、500 mg/L Carbincine、300 mg/L Kanamicine、0.1 mg/L NAA、1.0 mg/L BAP、0.59 g/L MES、1.0 mg/L 1℃光照培养箱中，14 h 光照/10? 维生素、2.0 mg/L 甘氨酸、3%蔗糖、0.6-0.7%琼脂、pH 5.7-5.8）上，置于 24 h 黑暗条件下培养 1 个月； ⑤ 待愈伤组织长出绿芽时，切下绿芽并转入生根培养基（MS（大量元素、微量元素、CaCl2、FeSO4）、200 mg/L Carbincine、100 mg/L Kanamicine、1.0 mg/L 维生素、2.0 1℃光照培养箱中，14 h 光照/10?mg/L 甘氨酸、1.5%蔗糖、0.6-0.7% 琼脂、pH 5.7-5.8）中进行筛选（9 棵/组培盒），置于 24 h 黑暗条件下培养筛选； ⑥ 将能在生根培养基中长出根的幼苗的芽切下，再次插入到生根培养基中，在相同培养 条件下继续筛选，挑选能长出根的烟草幼苗植入土壤生长。 根癌农杆菌转化烟草 方案二 农杆菌感受态细胞的制备 挑取根癌农杆菌 LBA4404 单菌落于 3ml 的