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利用连续传代法去除质粒 实验目的： 利用连续传代法使质粒丢失，以便进行下一步的基因敲除实验。 具体实验方案如下： 1、首先需鉴定我公司的菌种是否为营养缺陷型菌株。 取Lysine 单菌落，在基本琼脂培养基上划线，37 ℃培养，每天观察菌体生长 情况，如果该菌能在基本培养基上生长，则确定该菌为非营养缺陷型，如果不能 在基本培养基上生长，则可以确定该菌为营养缺陷型菌株。 如果鉴定 Lysine 菌为营养缺陷型，那么需要确定它是哪种氨基酸缺陷型， 鉴定的具体方案如下： （1 ）挑取Lysine 单菌落接种于5ml LB （含有25 μg/mL卡那霉素）液体培 养基中，37℃、200rpm 振荡培养30h。 （2 ）取1.5mL 培养液于离心管中，12000rpm 离心5min ，弃去上清液，菌 体用生理盐水洗涤2 次，打匀管底菌团，每次 12000rpm 离心5min ，最终悬浮于 1.5mL 生理盐水中，取 1ml 菌悬液涂布于基本琼脂培养基上，在培养皿的中央分 别放置蘸有5g/L 苏氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苏氨酸+蛋氨酸 和以上五种氨基酸混合液的滤纸片，37℃温箱中培养，定期观察，若某种氨基酸 周围有生长圈，即表明为该类营养物质的营养缺陷型菌株。 如果鉴定出 Lysine 菌为某种氨基酸营养缺陷型，那么在后续用的基础培养 基中均需加入该氨基酸以确保菌体能够生长。 2 、连续传代 首先，以时间为横坐标，菌液OD 值为纵坐标做一条菌体生长曲线，具体步 骤如下： （1 ）配置牛肉膏蛋白胨液体培养基 （2 ）按一定量分装到试管里 （需要13*3 支，3 支一组），灭菌。 （3 ）冷却后取Lysine 菌悬液，用移液枪分别接种到试管培养基中 (接种比列同 大发酵罐) （4 ）把 12 组放入37 度摇床培养，另一组马上测OD600 值，三个值取平均数， 偏差太大者舍去 （5 ）在2 、4 、6 、8、10、12、14、16、18、20 、22 、24 小时后分别测定其他 组的OD 值。 （6 ）将得到的值做图，确定对数生长中期所对应的时间。 然后挑取单菌落接种于5ml LB 液体培养基，在37℃以200 r/min 振荡培养使 Lysine 菌达到对数生长中期，取50 μL 菌液转接到5 mL 无抗性的基本液体培养 基中，37 ℃震荡培养。连续培养30-50 代，转接方法同上，所用的培养基也是无 抗性的基本液体培养基。 3、检测 在连续传代的同时，每传5 代检测质粒消除情况，检测方法如下： 取 100ul 菌液稀释1000000 倍后，再取稀释液 100ul 在无抗性的固体基本培 养基上涂布，37℃培养。待菌体长出后，挑取单克隆在无抗性的基本培养基上划 线，37℃培养。待菌体长出后，挑取单克隆于含有25 μg/mL 卡那霉素的固体基 础培养基上划线，如果能够生长，说明该质粒还没有消除或部分消除，如果没有 生长，那么可初步鉴定质粒已消除，需要提取质粒进行进一步限制性内切酶酶切 鉴定。 （每次检测所用到的有抗性和无抗性的平板均需要保留） 注： 1、LB 培养基：配制每升培养基，应在950ml 去离子水中加入胰化蛋白胨 10g， 氯化钠 10g，酵母提取物5g，用5mol/LNaOH 调节pH 至7.0 ，用去离子水最后 定容至1L，120℃灭菌20min 。 2 、M9 基本培养基： 配制1L 培养基，应在750ml 无菌去离子水中加入： 5-M9 盐溶液 200ml 1mol/L MgSO4 2ml 20%葡萄糖 20ml 1mol/L CaCl 0.1ml 灭菌的去离子水至980ml。如果需要，可在M9 培养基补加适当的氨基酸。 5-M9 盐溶液的配制：用去离子水溶解下列盐类，终体积为1L： 七水磷酸氢二钠 64g 磷酸二氢钾 15g 氯化钠 2.5g 氯化铵 5.0g 注：葡萄糖溶液在加入