纳豆激酶的发酵制药.pptx

纳豆激酶的发酵制药 人体内的血栓常引发脉管栓塞、脑血栓中风、急性心肌梗塞等严重的心脑血管疾病，对中老年人的身体健康造成了很大的危害，目前全世界有血栓患者约1 500 万人，潜在的溶栓剂市场有20 亿美元。但当前的溶栓剂，如尿激酶( SK) 和链激酶(UK) ，它们作为第一代溶栓剂，缺乏纤维蛋白选择性，副作用大；第二代溶栓剂如重组组织型纤溶酶原激活剂，存在着价格高的缺点等，难以成为适用于大众的药品。而纳豆激酶具有溶栓能力强、无任何毒副 作用、成本低、可由细菌发酵生产等优点，市场前景极为诱人。 须见洋行博士简介“天然物/生理机能素材研究委员会”会长 日本仓敷艺术科学大学产业科学技术学部学部长 著名生命科学家“纳豆激酶”的发现者 震惊—世界下午两点半实验1987年，平时非常喜欢日本传统饮食的须见洋行博士，有一天早晨看见饭桌上的纳豆后，突然想起血栓的主要成分不就是纤维蛋白吗？那么同样是蛋白发酵而生成的纳豆对溶栓会不会有一些作用呢？ 下午两点半的时候，须见洋行博士把提取的纳豆加入到人工血栓中，原本准备第二天来看实验结果，五点的时候，他看了一眼，奇迹发生了…… 纳豆激酶的性质纳豆激酶(Nattokinase , N K; 也称Subtilisin NAT ,Subtilisin BSP) 是由纳豆菌( Bacill us subtilis var. natto) 产生的一种具有强烈溶栓功能的蛋白酶，是一种枯草杆菌蛋白酶( Subtilisin)，属于水解酶类，催化蛋白质的水解。酶的分子量为27 728 ，远小于尿激酶的分子量54 000 。其pI值为8. 6。活性效果用固有单位FU表示。 纳豆激酶的生产工艺? 可以从纳豆菌的发酵液中提取得到纳豆激酶。由于纳豆激酶是胞外酶，故可省去了细胞破碎和缓冲液抽提的步骤。具体方法如下： （1）将购买或从纳豆中分离筛选得到的菌株接种到液体培养基中，37℃恒温培养，4 000 rpm离心30min，取上清液，即为粗酶液。 （2）用硫酸铵分级沉淀的方法除去杂蛋白、多糖等。取上清液缓慢加入硫酸铵至25％饱和度，低温过夜，4 000 rpm离心30 min去除杂蛋白，再取上清液，在上清液中再加入硫酸铵至终饱和度为60％，低温过夜，4 000 rpm离心30 min除去多糖类物质，收集沉淀，溶于缓冲液中，得到的为粗酶液。（3）粗酶液经透析脱盐，除去硫酸铵。（4）为了最终获得符合要求的产物，将样品进行多级层析，目的是先层析浓缩样品和去除杂质，再层析去除残存杂质、目的蛋白的多聚物或降解片段。凝胶层析和离子交换层析可提出较高纯度的酶，但是应注意层析介质的选择。 将发酵液经硫酸铵沉淀后通过Superdex 75凝胶层析和SPSepharose Fast Flow离子交换层析，发现经硫酸铵沉淀后得到的粗酶中杂蛋白不多，凝胶过滤可分离一部分杂蛋白，再经离子交换层析后，电泳可得到单一条带的纳豆蛋白产品，Mr为27 700。 以上每一步都要进行酶的活性测定。测定方法为：纤维蛋白块溶解时间( CLT) 法。该法也是参照t2PA、尿激酶等溶栓物质活性测定方法加以改进而建立的。 具体方法：0 ℃下，在小试管中依次加入凝血酶、巴比妥钠缓冲溶液、纳豆激酶样品溶液和纤维蛋白原，强烈搅拌，置于37 ℃恒温水浴中。从纤维蛋白形成起开始计时，随着反应液混浊，有气泡上升到液面，至气泡不再冒出时所用的时间作为纤维蛋白溶解的时间。同样以标准纳豆激酶或尿激酶、纤溶酶等作为标准品绘制标准曲线。以CLT 对纳豆激酶浓度的对数作图，在10～70μg 范围内有很好的线性关系。 经过上述步骤的分离纯化，纳豆激酶能达到电泳纯。酶的提取提纯数据记录步骤总蛋白/mg总酶活力/U比活力U/mg回收率/%纯化倍数上清498610683221.4?1硫酸铵沉淀65.878346126.71005.9Superdex 75凝胶层析14.657142487.685.622.8SP Sepharose Fast Flow离子交换层析8.575216608.662.528.4