生物技术第五讲2植物单细胞培养技术.pptxVIP

植物单细胞培养技术 周口师范学院生命科学系 第一页，共二十六页。1 植物单细胞培养的意义1.1 有利于观察细胞个体的分裂、分化、生长和繁殖情况；1.2 有利于获得纯细胞系；1.3 有利于进行细胞特性、细胞生长规律、细胞代谢过程及其调节控制规律等方面的研究；1.4 有利于生物转化和天然化合物的生产。第二页，共二十六页。2 植物单细胞的分离技术2.1 从外植体直接分离单细胞2.2 从愈伤组织分离单细胞2.3 通过原生质体再生法获得单细胞第三页，共二十六页。2.1 从外植体直接分离单细胞 外植体经过切割、捣碎或酶解，然后经过一定孔径的不锈钢筛网过滤，得到细胞悬浮液。 悬浮液中所含的完整细胞数量较少，但分散性好。 第四页，共二十六页。2.2 从愈伤组织分离单细胞 将愈伤组织进行振荡培养，使其分散成小的细胞团或单细胞，然后用适当孔径的不锈钢筛网过滤，除去大的细胞团和残渣，离心除去小的残渣，得到单细胞悬浮液。 为了增强分散效果，必要时可添加适量的果胶酶，使由果胶粘连在一起的细胞分开。第五页，共二十六页。2.3 通过原生质体再生法获得单细胞 外植体、愈伤组织或细胞团经过纤维素酶和果胶酶等的作用，除去细胞壁而获得原生质体。 外植体愈伤组织酶解原生质体再生细胞壁 愈伤组织单细胞悬浮液 再生植株第六页，共二十六页。3 植物单细胞的培养方法3.1 平板培养法（1960年，Bergman）3.2 看护培养法（1954年，Muir ）3.3 微室培养法（1960年，Jones）第七页，共二十六页。3.1 平板培养法 程 序： 2 单细胞悬浮液的密度调整 1 单细胞悬浮液的制备4 单细胞悬浮液与固体培养基等量混合3 固体培养基的配制5 暗培养6 继代培养第八页，共二十六页。3.1 平板培养法 程 序： 1 单细胞悬浮液的制备单细胞来源： 外植体(叶肉细胞)愈伤组织原生质体 第九页，共二十六页。3.1 平板培养法 程 序： 2 单细胞悬浮液的密度调整要求：调整后的密度为植板细胞密度的2倍调整方法：①如果密度过大，加入液体培养基进行稀释； ②如果密度小，通过低速离心使细胞沉降后，再加入适量液体培养基。第十页，共二十六页。3.1 平板培养法 程 序： 3 固体培养基的配制 当细胞植板密度过高(104或105个/ml)，使用和在悬浮培养中或愈伤组织培养中成分相似的纯合成培养基 当细胞植板密度过小，细胞对培养基的要求就变得越加复杂 注意：要选择适合单细胞培养的培养基第十一页，共二十六页。3.1 平板培养法 程 序： 4 单细胞悬浮液与固体培养基等量混合①当培养基凝固后，细胞能均匀的分布并固定在很薄一层(1mm)培养基中②在培养皿外对单细胞做标记，便于观察。第十二页，共二十六页。3.1 平板培养法 程 序： 5 暗培养注意：培养期间对细胞频繁的镜检会对细胞的生 长产生有害作用，应尽量减少镜检次数。第十三页，共二十六页。3.1 平板培养法 程 序： 6 继代培养 选取生长良好的由单细胞形成的细胞团，可以获得由单细胞形成的细胞系。第十四页，共二十六页。 初始植板细胞浓度对单细胞培养的影响 用平板法培养单细胞或原生质体时，常以植板效率来表示 。植板效率=每个平板上形成的细胞团数/每个平板上接种的细胞总数×100% 如果在琼脂培养基或液体培养基中，植板细胞的初始密度为1 ×104或1 ×105个/ml，植板后由相邻细胞形成的细胞群落常混在一起。 如果降低植板密度或完全孤立地培养单细胞，则可避免这个问题。但是当低于临界密度时，细胞就不能分裂。 原因是什么？ ？第十五页，共二十六页。 初始植板细胞浓度对单细胞培养的影响原因： 植物细胞的生长繁殖需要一定浓度的某些内源化合物。第十六页，共二十六页。 初始植板细胞浓度对单细胞培养的影响 如何培养完全孤立的单细胞？？第十七页，共二十六页。3.2 看护培养法 程 序： 将生长活跃的愈伤组织接种在固体培养基上 2 在愈伤组织块上方放置一片面积为1cm2的无菌滤纸，滤纸下方紧贴愈伤组织第十八页，共二十六页。3.2 看护培养法 程 序： 3 借助于微型移液管从细胞悬浮液中提取适量单细胞悬浮液 ，然后接种在无菌滤纸上面。 4 将在滤纸上由单细胞形成的细胞团转移到新鲜的固体培养基中进行继代培养，获得由单细胞形成的细胞系。 第十九页，共二十六页。为什么有愈伤组织的看护就能进行单细胞培养？可能的原因是： 1 愈伤组织的存在给单细胞传递了某些生物信息 2 愈伤组织为细胞的生长繁殖提供了某些物质条件第二十页，共二十六页。3.3 微室培养法 程 序： 1 借助于微型移液管从细胞悬浮液中提取适量单细胞悬浮液 ，置于一张无菌载片上。在这滴培养液四周与之隔一定距离加上一圈石蜡油，构成微室的”围墙”，