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蛋白组学二维电泳蛋白质染色方法胶内:考马斯亮蓝R-250 (CBB R-250)、CBB G-250、银染、负染、荧光染料染色以及放射性同位素标记等 转移到膜(PVDF、硝酸纤维素膜)上:酰胺黑(Amido Black)、丽春红S(Ponceau S)(一)考染(考马氏亮蓝染色)1、考马氏亮蓝与蛋白质反应机理 考马氏亮蓝(Coomassie brilliant blue)是一类三苯基甲烷衍生物。分为R-250(红兰色)、R-350 (红兰色) 、G-250(蓝绿色),它们与蛋白质结合生成深蓝色复合物,在464-595nm有吸收峰( 595nm 最大),且在比较宽的范围内(15-20 μg )扫描峰的面积与蛋白质量成线性关系,因此可在595nm对蛋白质进行定量检测,而且在一定pH条件下,这种染料-蛋白质复合物被完全解聚。2、考染机理 胶体内染料和溶液中自由扩散染料间形成平衡后,溶液中少量自由染料穿透凝胶基质,有选择性地对蛋白质进行染色,而胶体态的染料排阻在胶外,阻止了背景的生成。胶内蛋白质染色的关键是让蛋白质染色,而胶体不染色。Coommassie Brilliant Blue G-2503、考染程序考染程序至少600多种,主要变换是将以下程序中的醋酸换成三氯乙酸、磷酸或高氯酸,但三氯乙酸易使谷氨酸羧基侧链不可逆酯化,造成肽谱数据复杂化。(1)固定:凝胶浸泡于50%乙醇+10%冰醋酸水溶液中,至少1h,可过夜。(2)染色:凝胶浸泡于染色液中至少2h。染色液组成:45%甲醇+10%冰醋酸+0、25%考马氏亮蓝G-250,混均过滤。(3)脱色:多次更换脱色液,直至背景脱净,稍稍提高温度可加快脱色。脱色液组成:25%乙醇+8%冰醋酸。(4)保存:凝胶脱色后水洗扫描备份,用保鲜膜包裹,一个月内进行质谱鉴定;长时间保存需将蛋白点切下,进一步脱色后贮于-80 ℃。4、考染特点 (1)能够获得无背景或低背景的图谱;(2)染色过程需24-48h,所需时间较长;(3)灵敏度不高,为100-10ng,只能检测10- 100ng 的蛋白质,低丰度的蛋白质难以显色。(二)银染1、原理: 碱性银氨(Ag(NH3)2+)染色法和酸性硝酸银(AgNO3)染色法。 酸性硝酸银染色法的原理是一个照相的过程,凝胶在酸性环境下与硝酸银温育,银离子附与蛋白质表面,然后在碱性环境下里用福尔马林还原成金属银。 碱性银氨染色法的原理是用氨水来形成银氨复合物,银氨复合物与胶内SDS-蛋白质复合物结合,然后在酸性条件下用福尔马林将银氨还原成金属银。2、特点(1)酸性银染染色背景浅、容易控制,对酸性蛋白质的染色灵敏度稍高,碱性银染灵敏度稍高,但背景深、不容易控制。(2)相关于考染,灵敏度高,可达200pg。(3)但由于存在戊二醛的特异性反应,对下一步的酶切肽谱提取存在困难;增敏过程蛋白质被部分提取至胶外。3、程序1、 分析型银染(不能用于质谱鉴定) (1) 水洗胶5 min;(2) 40%乙醇,10%乙酸固定1 hr;(3) 5%乙醇,5%乙酸固定过夜;(4) 水洗20 min两遍;(5) 5%戊二醛 1hr;(6) 水洗30 min四遍;(7) 250mL新鲜配制的银氨液(1mL NaOH 与5mL 饱和氨水混合再加10mL 20%AgNO3)/胶45 min;(8) 水洗3 min三遍;(9) 1、5mL 1%柠檬酸、125μL 37%甲醛/胶显色;(10) 5%乙酸停显10min;(11) 水洗10 min三遍。2、 快速银染(和质谱鉴定相匹配)(三)负染1、特点(1)负染能提高SDS胶上蛋白质的回收率,常用有铜染、锌-咪唑染等。负染色结果在凝胶表面产生半透明背景,而凝胶显示黑色背景或相应底色,蛋白质以透明形式被检测出来,而且蛋白质被特别好地保存下来。(2)显色过程仅需5-15min(3)蛋白质易从胶上取出,一般用EDTA络合金属离子就可转移出蛋白质。(4)灵敏度15ng2、原理(锌-咪唑染料) 咪唑存在时,自由或弱结合的锌离子以锌-咪唑形式沉淀下来,而大部分锌离子因与蛋白质结合牢固而留在胶上,从而导致半透明背景上的空白区域,这就是负染过程。人肝癌细胞系MHCC97的部分双向凝胶电泳锌染图谱锌染程序(1) 水洗1 min;(2) 0、2 mol/L 咪唑、0、1% SDS溶液10 min;(3) 0、2 mol/L 氯化锌1 min;(4) 水洗5 sec三遍;(四)荧光染色(Cy3和Cy5)1、原理: 利用荧光染料对蛋白质进行标记,在光激发下产生荧光,通过扫描得到图象。比如用甲基Cy3与甲基Cy5两种染料分别对两个不同蛋白样品进行荧光标记,并在一块2-DE胶上进行运行,由于两种染料激发波长不同,扫描时可得到两张有差异的图象,因此可用于差异蛋白质组学研究。2、特点(1)灵敏