基因工程涉及的主要技术.ppt

5. PCR的应用 理论上只要一条模板链，32次循环就可合成约109条！ （1）扩增某一段DNA 从基因组中扩增； 从载体上扩增； 组织样本原位扩增； 微量残留DNA扩增； 分析模板序列； 第二十八页，共五十七页。 在基因的某处引入核苷酸突变（缺失、重复、插入、替换等）。 （2）基因的体外诱变 技术关键： 利用引物的5‘端序列不要求与模板严格配对，设计引物时引入突变序列。 第二十九页，共五十七页。 五、分子杂交 概念：将存在于凝胶中的生物大分子转移（印迹）于固定化介质上并加以检测分析的技术。可用于从基因文库中钓取目的基因等。 目前常使用的主要有Sourthern杂交、Northern杂交、Western杂交和原位杂交等。 第三十页，共五十七页。 核酸分子杂交 核酸分子杂交技术（DNA/DNA or DNA/RNA），是在1968年由华盛顿卡内基学院（Cavnegie Institute of Washington）的Roy Britten及其同事发明的。 所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。 DNA-DNA 杂交双链分子 同源或部分同源探针 总cDNA探针 特异性cDNA探针 人工合成的寡核甘酸探针 第三十一页，共五十七页。 探针标记 放射性标记 32P，3H，35S，14C，125I 等 非放射性标记 地高辛，生物素，荧光素等 用于标记dUTP 第三十二页，共五十七页。 （a） （b） （c） （d） （e） 基因组DNA DNA限制片段 硝酸纤维素滤膜 同探针同源杂交的基因DNA片段 X光底片 Southern 凝胶转移杂交技术 如图:基因组DNA经限制性内切酶消化后，进行琼脂糖凝胶电泳，将含有DNA片断的凝胶放入变性溶液变性后，将硝酸纤维膜(NC)膜放在胶上，上面放吸水纸巾，利用毛吸作用使胶DNA转移质NC膜上，然后利用杂交技术检测NC膜上的DNA片断。 第三十三页，共五十七页。  第三十四页，共五十七页。 1979年，J.C.Alwine等人发展而来，是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与萨瑟恩DNA印迹杂交技术十分类似，所以叫做诺赛恩RNA印迹技术（Northern blotting）但它不需要限制性内切酶切割。用于基因表达的特异性分析和定量分析。 而将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射性同位素125I标记的特定蛋白质的抗体进行反应，这种技术叫做韦斯顿蛋白质杂交技术（Western blotting）。 第三十五页，共五十七页。 第三十六页，共五十七页。 原位杂交：是将分子杂交与组织化学相结合的一种技术。它是利用标记的已知核酸探针，在组织、细胞及染色体上检测特异的DNA或RNA序列的核酸杂交技术。如菌落和噬菌斑印迹法(colony and plaque blotting)； 第三十七页，共五十七页。 五、DNA测序技术 一、Sanger双脱氧链终止法 二、Maxam-Gilbert化学分析法 第三十八页，共五十七页。 　　双脱氧链终止法是现在应用最多的核酸测序技术，由Sanger等1977年提出。主要用于DNA基因分析。 Frederick Sanger, 1980年Nobel Prize化学奖 一、Sanger双脱氧链终止法 第三十九页，共五十七页。 第四十页，共五十七页。 * * * * 基因工程涉及的主要技术 遗传专业 姓名：张红 学号1310170039 导师：张斌 第一页，共五十七页。 基因工程 基因工程（Genetic engineering）原称遗传工程。从狭义上讲，基因工程是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。 第二页，共五十七页。 基因工程的操作流程 DNA和RNA的提取和纯化 PCR扩增 构建基因文库，从基因文库中“钓”取 1、目的基因的获取 2、基因表达载体的构建 3、将目的基因导入受体细胞 4、目的基因的检测与鉴定 限制酶的切割与连接 农杆菌转化法等 分子杂交及DNA测序 第三页，共五十七页。 基因工程主要技术 DNA和RNA的提取和纯化 凝胶电泳 基因扩增技术-PCR反应 分子杂交 DNA序列测序 1 2 3 4 5 第四页，共五十七页。 一、DNA和RNA的提取和纯化 核酸是遗传信息的载体，是最重要的生