生物素亲和素标记技术省公开课一等奖全国示范课微课金奖PPT课件.pptxVIP

生物素、亲和素标识技术;一、生物素及其理化性质 1 概念 2 分子式 结构特点 溶解特征 等电点 其它特征 ;1 概念： 生物素(biotin)是动、植物体内广泛分布一个小分子生长因子，又名辅酶R或维生素H。 分子式： C10H16O3N2S 分子量：244.31;结构特点： 咪唑酮环/四氢噻吩环 结合亲和素 侧链末端羧基结合蛋白质 溶解特征： 难溶于水，易溶于二甲基甲酰胺(DMF);等电点： PH=3.5 其它特征： 羧基需经活化修饰才能结合蛋白质 （羧基活化生物素，称为活化生物素，也叫生物素衍生物）;生物素衍生物种类及特征： 1 生物素羟丁酰亚胺酯(BNHS)： DMF 制备：生物素 + N-羟基琥珀酰亚胺 二环己基碳二亚胺 标识特点： BNHS中羧基与蛋白质中赖氨酸氨基 结合到达标识目标 适合用于：标识Ab、酶、中性或偏碱性Ag、DNA;长臂活化生物素(BCNHS)： DMF + 6-氨基己酸 制备：生物素 + N-羟基琥珀酰亚胺 二环己基碳二亚胺 (在BNHSB与羧基之间插入2分子6-氨基己酸 ） 标识特点: (同BNHS) BCNHS中羧基与蛋白质中赖氨酸氨基结合到达标识目标 适用：(同BNHS) 标识Ab、酶、中性或偏碱 性Ag、DNA;3 生物素酰肼(BHZ)： 制备：生物素 +水合肼 标识特点： BHZ与蛋白质中醛基结合而标识 适用：标识偏酸性蛋白质、酶、DNA;三、亲和素及其理化性质 1 概念 2 分子式 结构特点 溶解特征 等电点 其它特征;1 概念： 亲和素(avidin)：是动物微生物中提取一个含10%碳水化合物碱性糖蛋白。 链霉亲和素：是从链球菌属菌培养液中提取一个蛋白质 分子量： A: 6.7KD SA: 6~6.5KD ;3 结构特点： 每分子由四个亚基组成 溶解特征：溶于水，C=5mg/ml 等电点： A: PH=10.5 SA: PH= 6.0 比活性： A≥12u/mgP SA ≥14u/mgP;四、亲和素活性及其测定 1 亲和素活性：是表示亲和素结合生物素能力，即：ugB/mgA或ugB/mgSA。;???性测定： ⑴ 羟基偶氮苯-2-羧酸(HABA)法： A(SA) + HABA（红色） B A-B （出现黄色时B量） ⑵ 分光光度法：;五、生物素标识物及亲和素标识物制备： 1 生物素标识物制备： B +Ab/Ag/E 交联剂 B-Ab/Ag/E 亲和素标识物制备： A/SA+ Ab/Ag/ E 交联剂 A/SA-Ab/Ag/E;六、技术类型： 可有Ag与Ab反应各种免疫方法：夹心法、间接法、竞争法等，在次基础上引入A-B系统。 BAB法： Ag+B·Ab Ag-Ab·B A Ag-Ab·B-A B·E Ag-Ab·B-A-B·E 特点：以游离A分别连接B-Ab和B-E ;BA法： Ag+B·Ab Ag-Ab·B A·E Ag-Ab·B-A-B·E 特点：以A-E/SA-E代替BAB法中A，省 却了加B-E步骤;ABC法： ⑴ A+B·E A- B·E----------ABC ⑵ Ag+B·Ab Ag-Ab·B ABC Ag-Ab·B-ABC 特点：将BAB法中A先与B-E结合，制备成复合物ABC;返回; Ag-Ab1-Ab2-B + A-E