蛋白质免疫印迹技术及常见问题.pptVIP

第一页，共二十九页，2022年，8月28日 免疫印迹技术的基础-免疫反应 免疫测定(immunoassay) 利用抗原抗体 反应来测定标本中抗原或抗体的方法 检测对象：具体免疫活性的物质 反应特性：高度的特异性和敏感性 第二页，共二十九页，2022年，8月28日 Western Blot原理简介 Western Blot一般流程 Western Blot常见问题分析 内容概要 第三页，共二十九页，2022年，8月28日 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。 Western Blot 原理 第四页，共二十九页，2022年，8月28日 目的蛋白的表达特性分析 目的蛋白与其它蛋白的互作 目的蛋白的组织定位 目的蛋白的表达量分析 Western Blot 的应用 第五页，共二十九页，2022年，8月28日 Western Blot原理简介 Western Blot一般流程 Western Blot常见问题分析 内容概要 第六页，共二十九页，2022年，8月28日 Western Blot 流程 蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色 第七页，共二十九页，2022年，8月28日 通过水溶法或有机溶剂制备总蛋白 水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。 有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括 乙醇、丙酮和丁醇等。 通过层析或电洗脱法制备目的蛋白 蛋白样品的制备 第八页，共二十九页，2022年，8月28日 蛋白样品的定量 Bradford法 考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白结合后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处有最大吸收值，化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比 。 TIANGEN产品 Bradford蛋白质定量试剂盒 第九页，共二十九页，2022年，8月28日 不连续的电泳缓冲体系。 SDS—蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 第十页，共二十九页，2022年，8月28日 凝胶成分 N,N’-亚甲双丙烯酰胺和丙烯酰胺?? SDS 配胶的Tris缓冲液 TEMED 过硫酸铵 Tris-甘氨酸电泳缓冲液 第十一页，共二十九页，2022年，8月28日 凝胶浓度与蛋白分离范围 凝胶浓度（％） 线性分离范围（KD) 15 12-43 10 16-68 7.5 36-94 5.0 57-212 第十二页，共二十九页，2022年，8月28日 转膜 膜的选择 尼龙膜 硝酸纤 维素膜 封闭非特异性抗体结合麻烦 简单快速封闭非特异性抗体结合 价格昂贵 价格便宜 特殊要求下的选择 需要更高的蛋白结合率 （尼龙膜： 480μg/cm2 ；硝酸纤维素膜：80μg/cm2 ） 目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱 需要更大的机械强度 第十三页，共二十九页，2022年，8月28日 湿法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中，电转45min或过夜。 半干法 将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间，电转10－30min。 转膜方法 第十四页，共二十九页，2022年，8月28日 丽春红S染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤 维素滤膜，换水几次。 印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探 针的Western印迹过程。 转膜后检测 第十五页，共二十九页，2022年，8月28日 转膜后的封闭 脱脂奶粉 BSA Western Blot 膜封闭液 （生物试剂公司提供） 把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积以0.1ml/cm2的量加入封闭剂，摇床上平缓摇动，于室温温育1-2小时。倒掉缓冲液，立即加入一抗溶液与滤膜温育。 第十六页，共二十九页，2022年，8月28日 一抗用量也根据0.1ml/cm2来计算，室温1-2小时。 倒掉一抗溶液，用250ml PBS漂洗液滤膜3次，每次 10min。 加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，室温温育 1-2小时。 一抗、二抗孵育 第十七页，共二十九页，2022年，8月28日 二抗与底物反应显色 辣根过氧化物酶法 碱性磷酸酶法 化学发光显色法 Anti－His 第十八页