融合蛋白柔性linker的选择.docx

蛋白融合L in ker 得设计与选择 接头序列( L inker)设计就是基因融合技术能否成功得关键技术之一。 即通过一段 适当得核苷酸序列将不同得目得基因连接起来, 使其在适当得生物体内表达成 为一条单一得肽链, 其中起连接作用得氨基酸称为Lin k er [1]。融合蛋白中得 两种成分能否分别形成正确得空间结构、 更好得发挥生物学活性, 与连接融 合蛋白中两种成分得接头序列密切相关、重组生成得融合蛋白要求插入融合蛋白 中得l inker 不能影响目得蛋白各自得功能。因此, Linker 序列得设计与选择对 融合基因得构建至关重要。 针对 Linker 序列得设计与选择己有诸多相关得研究[2] 。目前得研究主要有两 种, 即螺旋形式得 Linker 肽如[A(EAAAK)nA] 与低疏水性、 低电荷效应得氨 基酸组成得接头, 以后者应用较广泛。这种低疏水性、 低电荷效应得氨基酸组 成得多肽接头能够充分伸展以分开两种融合得组分, 使之能在互不干扰得情况 下充分折叠成各自得天然构象。Ryoichi 等[ 3 ]在两种不同功能得融合蛋白之 间插入了不同类型得 linker 序列, 包括可形成螺旋状得不同长度得肽链、 柔性 link e r以及葡萄糖球菌蛋白A(PA)。结果发现螺旋状得l ink e r 同柔性 li n ker 及PA 一样, 可以有效得将融合蛋白得两个结构域分开, 甚至可增强融合蛋白 得功能、L i nker 得长度就是融合基因构建得又一个重要得因素、如果 Li n ker 得 长度过长, 则使融合蛋白对蛋白酶比较敏感, 导致活性融合蛋白在生产过程中 得产量下降; 应用较短得 L i nk e r, 可以克服重组蛋白酶分解得问题, 但可使两 个融合分子相距太近导致蛋白功能得丧失。Link e r 得长度不应小于 3 。5 nm , 这就是由于相邻肽键得距离为 0 、 38 n m, 因此连接肽至少应包含 10 个氨 基酸。目前最为常用得就是Huston 设计合成得(GGGGS) 3序列。研究发现, 连接肽为(Gly 4Se r)3 得融合蛋白表现出较高得复性效率。这可能就是(Gly4 Ser) 3连接肽较长且柔软, 在复性时能够降低融合蛋白得两组份间得空间位阻, 从而更有利于融合蛋白各个结构域得正确折叠。所以, Linke r 得长度不能过 长也不能过短。 Linker 得选择, 还应考虑 L i n ker 内部得氨基酸序列, 研究发现, L in k er 组成相同但序列不同时, 构建得融合蛋白得稳定性存在显著差异; 编码 Linker 得 核苷酸组成, 调整编码 Linker 得核苷酸组成, 虽不改变原接头Linke r 得氨基 酸序列, 但融合蛋白得表达存在显著差异、Linker 序列中有太多得 α 螺旋与 β 角 结构会限制融合蛋白得伸缩性, 进而影响融合蛋白得生物学活性。 总之, Link e r得选择不就是一成不变得, 而要根据融合蛋白分子得大小与特性来决定。 细胞因子就是由免疫细胞与某些 细胞因子就是由免疫细胞与某些非免疫细胞经刺激而合成、 分泌得一大类多功能、 高活性 得生物物质。它在介导机体多种免疫反应及对各类免疫活性细胞得分化、 发育与活化中起 着十分重要得作用。 细胞因子融合蛋白( c yt o kine f u sion prote i n)技术就是当今免疫学研 究得一个热点方向。该方法就是基于这些细胞因子具有相同或相关得功能活性而各自作用靶 点不同, 利用基因工程技术将两种或多种细胞因子融合在一起, 其融合基因表达产物既具有 其组成因子独特得生物学活性或使其某些活性显著提高, 还可能会通过生物学活性得互补 及协同效应发挥出较单一细胞因子简单配伍所不具备得复合生物学功能, 甚至还可能会产 生一些新得结构及生物学功能, 这种新型得人工蛋白具有极高得应用价值与良好得发展前 景。早在 1986年 S eno 等用含 E c oR I 得 1 2个核苷酸(4 肽)CCGGAATTCATG为接头, 将 将 IFN γ 与 IL 2 片段加以连接, 结果发现产生得融合蛋白具有 IFN γ 与 IL 2 得双 重活性、迄今为止, 国内外已相继报道了多种有价值得细胞因子融合蛋白。现就细胞因子融 合蛋白技术得原则、 构建类型、 应用现状以及发展前景做一简要概述。 1 细胞因子蛋白融合技术 1.1 蛋白融合得构建原则 基因工程构建细胞因子融合蛋白须满足以下几个条件: (1)各 融合分子得目得 DNA 片段置于同一套调控序列(包括启动子、 增强子、 核糖体结合序列、 终止子等)得控制之下。