醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质.pptVIP

第一页，共二十二页，2022年，8月28日 一、实验目的 1. 掌握电泳分离的蛋白质的基本原理 2. 熟悉醋酸纤维薄膜电泳技术 第二页，共二十二页，2022年，8月28日 二、实验原理（一） 电泳：带电粒子在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。 电泳技术: 利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术。 第三页，共二十二页，2022年，8月28日 二、实验原理（二） 蛋白质是两性电解质。血清中各主要蛋白质的等电点均低于pH7.0，在pH8.6的碱性缓冲液中，电离成负离子，在电场中向正极泳动。 因血清中各种蛋白质的pI值不同，在同一pH缓冲液中带电荷量会有不同，此外，各蛋白质的分子大小和形状也不一致，所以在同一电场中，各蛋白质的电泳迁移率也不同。带电荷多、分子量小者，泳动较快，反之则慢。 第四页，共二十二页，2022年，8月28日 醋酸纤维薄膜电泳可将血清蛋白分成五条主要区带，从正极端起依次为清蛋白/白蛋白Alb， α1-球蛋白，α2-球蛋白，β-球蛋白, γ-球蛋白。这些蛋白经过染色处理，可展示出清晰的蛋白电泳图谱。如下图所示。 二、实验原理（三） 第五页，共二十二页，2022年，8月28日 由于染色时，染料与蛋白质的结合与蛋白质的量成正比。因此可将实验图片扫描后，根据每个蛋白条带的光密度，采用软件计算每种蛋白质的相对含量。 也可将各蛋白区带剪下，分别用一定量的NaOH稀溶液洗脱，进行比色，测出各蛋白质区带的相对含量。 二、实验原理（四） 蛋白定量： 第六页，共二十二页，2022年，8月28日 影响电泳的因素 第七页，共二十二页，2022年，8月28日 三、实验器材 卧式电泳槽 DYY-2型电泳仪 第八页，共二十二页，2022年，8月28日 醋酸纤维薄膜（CAM,2 cm×8cm）：1片/人。 染色缸1个，公用。 漂洗缸3个，公用。 点样器：公用。 滤纸：公用。 镊子：公用。 第九页，共二十二页，2022年，8月28日 脱色摇床 第十页，共二十二页，2022年，8月28日 扫描仪 第十一页，共二十二页，2022年，8月28日 四、实验试剂 巴比妥-巴比妥钠缓冲液（pH8.6，离子强度0.06） 染色液（丽春红S染液） 漂洗液：3%（V/V）冰醋酸 第十二页，共二十二页，2022年，8月28日 迎着光辨别醋酸纤维薄膜（CAM）的光面和毛面。 在毛面的一端1.5cm处，用直尺和铅笔轻划一横线，做点样标记，并用铅笔标号。 将已经编号、标记的CAM膜以毛面朝下的方式浸入巴比妥缓冲液中，浸泡30 min。 五、实验操作 实验准备： 1）醋酸纤维薄膜的准备 第十三页，共二十二页，2022年，8月28日 电泳装置由电泳槽和稳压电源两部分组成，两者之间有专门的连线连接。电泳槽的正负极各有一个装缓冲液的槽，红色为正极，黑色为负极。电泳槽置于水平台，两侧注入等量的巴比妥缓冲液，使其在同一水平面。用双层纱布搭桥。 2）电泳装置的准备 第十四页，共二十二页，2022年，8月28日 1）用镊子取出浸透的薄膜，夹在两层粗滤纸内吸干多余的缓冲液，然后平铺在桌子上（毛面朝上）。 2）在一次性手套上滴一滴血清（3-5μl），用点样器在血清上蘸一下，再将点样器轻印在CAM膜的点样线上，待血清完全渗透到薄膜内后移开。 2.点样 第十五页，共二十二页，2022年，8月28日 1）将加样后的薄膜，毛面向下，垂直架于电泳槽的游杆两端，点样端置于负极，纱布将膜的两端与缓冲液连通 2）将电泳槽的正极和负极分别与电泳仪的正极、负极连接，打开电源，低压，平衡5min。调节电压至90-150V (110V),稳压电泳45min。 3）待电泳区带展开约25-35mm后，关闭电源。 3.电泳 第十六页，共二十二页，2022年，8月28日 电泳完毕后，取出薄膜，以毛面朝下的方式浸于丽春红S染色液中，染色5-10min。 4.染色 将染色过的薄膜依次放在漂洗缸1,2,3中漂洗，每次5 min 5.漂洗 第十七页，共二十二页，2022年，8月28日 将漂洗好的CAM薄膜放置在滤纸上，吸干水分，放入扫描仪中进行扫描，并用软件分析各种蛋白质的相对含量。 6.定量 各组分蛋白%=AX/AT ×100% AX:各组分蛋白光密度值 AT:血清各组分蛋白光密度值之和 7.计算 第十八页，共二十二页，2022年，8月28日 薄膜的浸润是电泳成败的关键之一。 点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，但不宜太干。 点样时，动作要轻、稳，用力不能太大。 电泳时应选择合适的电压，一般稳压在为110 V。 通电时，不得接触槽内的缓冲液或CAM，以防触电。 电泳槽缓冲液的液面要保持一定的高度，同时电泳槽两侧的液面应保