遗传病的分析5DNA扩增产物的鉴定.pptVIP

遗传病的分析5DNA扩增产物的鉴定 限制性内切酶酶切技术琼脂糖凝胶电泳技术 一、限制性内切酶酶切技术 原 理§§ 限制性内切酶大多由大肠杆菌中提取纯化得限制性内切酶大多由大肠杆菌中提取纯化得到，能特异性识别和切割双链DNA分子中的的特特异异序序列列（一一般般识识别别4－－6个个核核苷苷酸酸序序列列）4 6§§ 由于大多数内切酶具绝对的位点特异性，因由于大多数内切酶具绝对的位点特异性，因此可以选择合适的内切酶切割扩增产物，通过片段大小鉴定基因是否有缺失或缺陷。 原 理本实验使用限制性内切酶（Lwe I） ，酶切位点：5′….GCATC(N) ↓…3′53′….CGTAG(N) ↑….5′9正正常常人人样样品品具具有有酶酶切切位位点点，能能够够被被酶酶切切开开，分成2个片断；而病人组G则被A替代，酶切2位位点点丧丧失失，不不能能被被酶酶所所切切动动，所所以以还还是是１个个片断。 器材与试剂§ 高速离心机、恒温水浴箱、移液枪、枪头、塑料离心管等§ Lwe I限制性内切酶、三蒸水、缓冲液等 操 作11、取取样样品品22份份（病病人人、正正常常人人PPCCRR扩扩增增产产物物）无菌ddH O 14ul2缓冲液10× 2ul20ul混匀扩增产物 3.5ul内切 酶0.5ul2、置37oC水浴3h（或过夜） 注意事项§ 内切酶需在－20℃环境中保存。§ 内切酶活性的发挥需要Mg 。2＋§§ 为使酶反应时达到最佳条件，需使用生产厂为使酶反应时达到最佳条件，需使用生产厂商提供的反应条件或缓冲液。 二、琼脂糖凝胶电泳技术 原 理§§ 溴化乙啶（EB）是一种高度灵敏的荧光染色剂，用于观察溴琼化脂乙糖啶凝（E胶B中）是的一D种NA高。度E灵B用敏标的准荧光30染2n色m剂紫，外用于光观透射仪激发并放射出橙红色信号，可用带CCD 摄像头的凝胶成像处理系统拍摄。§§ 一定量的DNA加入琼脂糖凝胶，能与凝胶中的EB结合，在在一T定AE量介介的质质DN溶溶A液液加中中入，琼进进脂行行糖电电凝胶泳泳，。能由由与于于凝电电胶场场中作作的用用EB，结D合NA，TAEDNA分子会从负极向正极泳动，分子量小的泳动在前，大的在后，形成不同的DNA条带。此时用紫外透射仪可以检测之。§ 以标准Marker为参照物，可以得知被检DNA的大小。 器材与试剂§ 紫外透射仪、电泳仪、电泳槽、凝胶板、凝胶梳、橡皮膏、薄膜、移液枪、枪头、塑料离心管等§ 1％琼脂糖（含EB）、DNA样品、标准Marker、溴酚蓝溶液、TAE缓冲液等 操 作1、制备1%凝胶板：配置好的琼脂糖溶液加热溶解后，至50-60 ℃时，浇板；冷却后，置电泳槽内，并轻轻拔出梳子。2、制备上样样品3份（Marker、病人及正常人酶切产物）：每份样品在塑料薄膜上加：溴酚蓝溶液 6 ×样品1ul５ul混匀3、点样：吸取混合好的上样样品，轻轻加入琼脂糖凝胶孔内。4、电泳：接通电源（80mA），约30min。5、鉴定：取凝胶置紫外透射仪察看、照相、分析。 结 果 注意事项溴化乙啶（EB）是强诱变剂，具有高致癌性！ 定义：§ 细胞培养§ 细胞分裂指数§ 细胞活率§ 细胞的生长曲线§ 细胞周期§ 细胞培养的生命周期§ 细胞系、细胞株§ 细胞“代”§ 微核§ 系谱分析