(32)--3.5.1亲和纯化技术简介生物制药工艺学.docVIP

亲和纯化技术 第一节 亲和纯化技术简介 同学们好，本章我们将对亲和纯化技术进行系统的学习， 生物物质，特别是酶和抗体等活性物质，具有识别特定物质并与该物质的分子相结合的能力，这种识别并结合的能力具有排他性，即w物分子能够区分结构与性质非常相近的其他分子，选择性的与其中的某一种分子相结合，生物分子间的这种特异性相互作用，称为生物亲和作用或简称亲和作用，通过亲和作用发生的结合，称为特异性结合或亲和结合，利用生物分子间的这种特异性结合作用的原理，进行生物质分离纯化的技术称为亲和纯化技术。 利用生物亲和作用的原理，纯化蛋白质的报道，最早见于1910年，当时发现不溶性淀粉，可以选择性的吸附阿尔法淀粉酶。但真正有意识的应用生物亲和作用，纯化蛋白质的研究却是始于20世纪50年代初。1951年坎贝尔等利用半抗原修饰纤维素制备的载体，作为亲和吸附介质，从血清中纯化了抗体，但由于亲和吸附介质制备技术的障碍，清和纯化技术的实用化进程缓慢。直到1967年，阿克森和夸特雷卡萨斯等开发了利用溴化氰活化琼脂糖凝胶，制备亲和吸附介质的方法，才使亲和纯化技术从研究走向实用，亲和层析这一名称也是此时首次出现，亲和层析法也是亲和纯化技术当中比较成熟的代表性技术，我们将在下一节内容中着重进行分析。 20世纪80年代以后，利用生物亲和作用的高度特异性与其他分离技术，如膜分离，双水相萃取，反胶团萃取，沉淀，分级和电容等结合，相继出现了亲和过滤，亲和分配，亲和反胶团萃取，亲和沉淀和亲和电泳等亲和纯化技术。下面，我们就来对这几种亲和纯化技术进行简单的介绍。 首先，我们来学习亲和过滤技术。亲和过滤技术包括亲和错流过滤和亲和膜分离两大方法。亲和错流过滤是将亲和层析与超滤技术结合，高分子底物经专一可逆的亲和反应后，用膜进行错流过滤，兼有亲和层析与膜过滤的优点。现已被广泛应用于蛋白质，酶等生物大分子的分离纯化，是目前分离选择性最好，纯化倍数较高的实验室分离纯化方法。亲和膜，利用亲和配基修饰的微滤膜为亲和吸附介质，亲和纯化目标蛋白质，是固定床亲和层析的变形，所以又称膜亲和层析。该方法具有传质阻力小，吸附快，降压小，流速快，设备体积小，配基用量低和利用率高的优点，是一种备受瞩目的新型分离方法。 接下来，我们来了解一下亲和萃取技术。利用偶联亲和配基的聚乙二醇为成相聚合物，进行目标产物的双水相萃取，可在亲和配基的亲和作用下，促进目标产物在聚乙二醇相的分配，提高目标产物的分配系数和选择性，这就是亲和萃取，又称亲和分配。亲和分配纯化过程可经过三步操作完成，分别为亲和分配，杂蛋白质反萃取和目标产物萃取，也就是进料清洗和洗脱。亲和萃取技术，不但拥有双水相处理量大的特点，还具有选择性高的特点，可以连实现连续操作。 反胶团是表面活性剂在有机溶剂中形成的自聚集体，其内部的水池可溶解氨基酸，多肽和蛋白质等生物分子，因此反胶团可用于生物产物的萃取分离，关于反胶团萃取的相关知识，我们在此前的课程中已经学习过了。而亲和反胶团萃取，则是指在反胶团相中，除通常的表面活性剂以外，添加另一种，亲水头部为，目标分子的亲和配基的助表面活性剂，通过亲和配基与目标分子的亲和结合作用，促进目标产物在反胶团相的分配，提高目标产物的分配系数和反胶团萃取分离的选择性，最终达到分离纯化的目的。其中，亲和助表面活性剂的配基和疏水链长度是影响亲和反胶团萃取的重要因素。 亲和沉淀技术，是生物亲和相互作用与沉淀分离相结合的蛋白质类生物大分子的分离纯化技术，根据亲和沉淀的机制不同，亲和沉淀又分为两种，即一次作用亲和沉淀和二次作用亲和沉淀。 水溶性化合物分子上偶联有两个或两个以上的亲和配基，前者称为双配基，后者称为多配基，一次作用亲和沉淀就是利用双配基或多配基可以与含有两个以上亲和结合部位的多价蛋白质产生亲和交联，进而增大为较大的交联网络而沉淀，其作用机制与抗原-抗体的沉淀作用相似。 二次作用亲和沉淀是利用在物理场改变时溶解度下降，发生可逆性沉淀的水溶性聚合物为载体固定亲和配基，制备亲和沉淀介质，亲和介质结合目标分子后，通过改变物理场使介质与目标分子共同沉淀的方法。 亲和沉淀纯化技术具有诸多优点，首先，配基与目标分子的亲和结合作用，在自由溶液中进行，无扩散传质阻力，亲和结合速度快。其次，亲和配基裸露在溶液之中，可有效的结合目标分子，配基利用率高。第三，利用成熟的离心或过滤技术回收沉淀，易于规模放大。第四，亲和沉淀法可用于目标物纯化的初期，有利于减少分离操作步骤，降低成本，也有利于提高目标产物的质量和收率。 亲和电泳技术，英文简称aep，将亲和层析的吸附剂，包埋到琼脂凝胶板上，制成AEP载体，在电泳时，对配基具有亲和作用的化合物迁移率下降，或保留在原点，现在AEP已经成为分析生物分子间特异作用的常用生化技术之一，被广泛应用于生物样品的分离纯化与鉴定，