(34)--3.5.3亲和纯化技术的应用.doc

第三节 亲和纯化技术的应用 前面的学习使我们亲和纯化技术有了一定的认识，可以看出该技术在生化物质的分离纯化方面具备突出的优势，下面我们进一步了解一下该技术的实际应用。 首先，我们来学习一下亲和层析的应用实例。 抑肽酶能抑制胰蛋白酶及糜蛋白酶，阻止胰脏中其他活性蛋白酶原的激活，及胰蛋白酶原的自身激活。临床用于预防和治疗急性胰腺炎，纤维蛋白溶解，引起的出血及弥漫性血管内凝血。目前，国产抑肽酶制备工艺，均采用亲和纯化技术。首先，取新鲜牛肺，经硫酸酸解后，进行板框过滤，滤液调整，PH值至7~8制得抑肽酶粗提液，用于亲和萃取。将粗提液加入到清河萃取体系，亲和萃取后，含抑肽酶的上相分，经过调整PH至1.5~2后，用超滤膜进行超滤后脱盐浓缩，最后将浓缩液冷冻干燥，获得高纯度的抑肽酶冻干粉。 蛋白A能特异与抗体FC区结合，所用蛋白亲和层析凝胶纯化抗体，是大规模克隆抗体纯化的首选步骤，一步纯化可使蛋白纯度达98%以上，并可去除包括宿主蛋白，宿主外源DNA，各种蛋白酶等绝大部分杂质，在大规模生产中，蛋白亲和层析纯化步骤的成本占整个抗体纯化成本的35%以上，h02单抗是一种重组单克隆抗体，临床上用于类风湿关节炎的治疗，h02单抗的纯化过程中，采用蛋白a亲和层析BPG300填料柱，使用枸橼酸缓冲液作为洗脱液，纯化后，经紫外分光光度计测定蛋白浓度，计算蛋白总量。 了解了亲和层析的部分应用之后，接下来，我们来介绍几种新型亲和层析技术知识。 生物亲和层析是利用自然界中存在的，生物特异性，相互作用物质对，的亲和层析，通常具有较高的选择性，典型的物质对，有：酶-底物，没酶-抑制剂，激素-受体等。通常酶的底物并不是合适的亲和配基，因为它们易于转化成产物，而影响目的产物的结合能力，但是在某些条件下，产物型配基也能与酶强烈的相互作用，因此，利用酶产物形物质对，更加有利于酶的纯化。比如，使用碱性磷酸酶抑制剂，与对氨基苄基磷酸配基，以琼脂糖为载体，分离纯化，从小牛肠中提取碱性磷酸酶，纯化倍数达3000倍，活性回收率达70%。但该法所用配基来源有限，价格昂贵，对未知蛋白，无法进行分离纯化。 免疫亲和层析是以抗原抗体中的一方作为配基，亲和吸附另一方的分离系统。由于抗体与抗原作用具有高度的专一性，并且他们的亲和力极强，所以许多典型的亲和层析纯化蛋白质过程，已使用单抗作为亲和配基。目前利用抗体抗原模式，有可能得到的每一种目标蛋白的单抗，都可以作为配基，通过亲和层析技术来分离纯化目标蛋白。比如，用纯化的草鱼生长激素单抗，偶联到溴化氰活化的琼脂糖4b凝胶上，制成亲和层析柱，可用于纯化，重组鲤鱼生长激素。利用马蝇幼虫，血淋巴凝集素的抗体制备亲和层析柱，通过免疫亲和层析一次性纯化了，马蝇幼虫血淋巴凝集素。研究者还使用，合成的阿尔法干扰素单抗高效液相亲和介质，纯化了由大肠杆菌表达的基因重组，人阿尔法干扰素，纯化倍数为79倍，活性回收率为94%。 金属离子亲和层析是利用金属离子的络合或形成螯合物的能力，吸附蛋白质的分离系统。蛋白质表面暴露的宫殿子，氨基酸残基如组氨酸的咪唑基，半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基，十分有利于蛋白质与固定化金属离子结合，这也是该方法用于蛋白分离的唯一依据。例如用壳聚糖涂层固化铜离子，亲和层析分离超氧化物歧化酶，纯化倍数达20倍，活性回收率为90%。利用固定化铜离子亲和层析分离大肠杆菌细胞抽提物，能够通过改变洗脱条件，分别得到细胞色素c和溶菌酶。该方法，蛋白质吸附量大，价格便宜，层析柱可长期连续使用，易于再生，具有普遍适用性。但与蛋白质的特异性差，会发生非特异性吸附，螯合在亲和载体上的金属离子，也有可能脱落混入产品，影响产品质量。 有机染料如蒽醌化合物和偶氮化合物具有类似脱氢酶辅酶的结构。因此一些需要核苷酸类物质为辅酶的酶，对这些染料具有一定的亲和力。通过将这些染料共价偶联到纤维素或琼脂糖等多糖载体上，就能制得亲和层析柱。常用的配基包括有机染料二羟金属偶氮复合物。染料亲和层析已经成功的分离纯化了多种酶，如各种水解酶，激酶，转移酶，核酸酶聚合酶，合成酶和限制性内切酶，转运rna合成酶，DNA连接酶等，该方法还被成功的应用于白蛋白，只蛋白和干扰素的分离纯化。 拟生物亲和层析是利用部分分子相互作用，模拟生物分子结构或特定部位，以人工合成的配基为固定相吸附分子目的蛋白质的亲和层析。其中，以氨基酸亲和层析和染料亲和层析为代表。染料配基能通过共价键牢固的结合到亲和载体上，由于价格低廉，与蛋白质的结合容量高，且理化性质稳定性高，是一种理想的基因特异性配基。比如，利用活性蓝色染料柱亲和层析，进行啤酒酵母脱氢酶组成型同工酶的纯化分离，取得了良好的效果。染料配基通常有毒性，且与蛋白质会发生非特异性相互作用，而多肽是亲和层析纯化生物大分子更有效的配基，其具有更高的特异性，无毒与蛋白质间的作