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实验方案 第一阶段（3~5 月，生菜种植） 一、 研究目的 研究不同粪肥（鸡粪、猪粪和有机肥）不同浓度施用对旱地农田土壤生态系统的影响。二、 研究内容 畜禽粪便污染情况： 畜禽粪便中抗生素残留及抗性基因污染分析； b)堆肥过程抗生素动态变化； … c)堆肥过程中抗性菌及抗性基因（tetG,tetC 和 sul1 等）丰度的变化情况; (2)畜禽粪便施用对农作物的影响 a)植物生理生态指标（叶绿素荧光，光合与蒸腾作用等）； b)抗生素在作物中的富集与分布特征； c)畜禽粪便对植物内生菌的影响。(3)畜禽粪便施用对农田土壤的影响： 不同施肥对土壤营养物质的转化情况和土壤肥力状况（土壤酶活，有机质和氮磷钾等）； 不同施肥对土壤呼吸，土壤温室气体排放的影响（CO , N O，CH ）; 2 2 4 } 施肥土壤中的抗生素残留及抗性基因污染情况； d)不同施肥对土壤重金属的影响。 畜禽粪便对土壤微生物的影响： 畜禽粪便施用后农田土壤多样性与结构的变化； b)抗生素抗性细菌和抗性基因的变化； 根据施肥土壤中 nifH 基因，AOB 和 AOA 的丰度估算粪肥对土壤N 循环的影响； 通过 cbbM,oorA 等基因的丰度估算粪肥对微生物固碳作用的影响。 三、 实验设计 · 试验采用蔬菜土壤，每块样地大小为2m×3m，共计 22 块样地，132 平方米，可根据现 场情况调节，具体安排见表 1。样地之间设计阻隔, 为防止各试验田小区互相渗透，田埂筑 高为 350 mm，并用 mm 的 HDPF 防渗膜包裹，交接处焊接，防渗膜埋深 m。生菜株行距适宜为 20cm。 粪肥 表格 1 平行样地（2m×3m） 粪肥施用量表 施肥量（kg/m2） 共计（kg） 1 3 2 ~ 3 3 3 4 6 有机肥 5 6 324 6 * 6 7 9 8 9 9 9 1 @ 3 2 3 3 ! 3 猪粪 4 6 324 5 . 6 6 6 7 … 9 8 9 9 ！ 9 1 6 鸡粪 2 — 108 6 3 6 对照组 1 — 0 0 共计 22 117 756 设计思路： $ 不同粪肥施用对农田土壤生态环境的影响：每种土壤设置 4 个处理：对照、鸡粪、 猪粪、有机肥，3 次重复；粪肥施用浓度为 3 kg/m-2，粪肥全部作为底肥一次性施入. 不同粪肥浓度梯度对农田土壤生态系统的影响：有机肥和猪粪土壤分别设置3 个浓度梯度：3 kg/m2 、6 kg/m2、9 kg/m2，3 次重复，粪肥全部作为底肥一次性施入。 四、 样品采集 土壤样品采集 使用无菌不锈钢土钻以五点取样法采集 500g 土壤样品，每个样品分成三部分，其中一部分土样，去除石砾、蚯蚓和植物残体等杂物，然后立即测定土壤含水率；一部分置于室内自然风干，研磨后，分别过 10 目和 100 目筛，置于 4℃冰箱冷藏，用于测定土壤理化性 质；一部分使用无菌袋密封，存放于-20℃冰箱冷冻保存，用于微生物量碳、酶活性和微生物多样性测试。 植物样品采集 生菜用蒸馏水冲洗后分为两部分（根和叶），然后后用无菌滤纸擦干。用新鲜的叶和根提取植物内生菌。冷冻干燥生菜样品被用来测抗生素含量。取3-5 株植株，用去离子水洗净晾干，称其鲜重，称量结束后，带回实验室 105 度杀青，80 度烘干至恒重称其干重。在 生菜采收期间阶段性的随机取 5 株为样品测定，称量其重量，以此估测每个样地产量。 《 五、 指标测量 测量方式指标便携式测量仪器（1 测量方式 指标 便携式测量仪器 （1）LI-8100A 土壤碳通量自动测量系统 pH，电导率、温度、含水率、土壤呼吸速率、土壤中 （2）WET-2 土壤水分温度电导率速测仪 现场测量 N2O、CH4 浓度等 （3）便携式痕量 N2O/CH4 土壤通量测定 系统（N2OM1-919） ! 土壤指标 土壤容重、土壤酶活（过氧化氢酶、土壤蛋白酶和土 非现场测量 壤脲酶等）、阳离子交换量，有机质、有机碳、氨氮、 硝酸盐氮、全氮、全磷、全钾、氨氮、速效氮磷钾、 抗生素和重金属等 （4）LI-6400XT 便携式光合作用测量系统 根长、株高、叶片数、叶面积、鲜重、叶绿素荧光（SPAD 现场测量 （5）FluorPen FP 110 手持式叶绿素荧光 值）、光合和蒸腾作用 植物指标 仪 / 干重、植株内重金属及抗生素含量，植物内生菌及抗 非现场测量 性基因的丰度等 土壤微生物量碳， 土壤微生物结构与功能，抗性基因 微生物指标 非现场测量 丰度， nifH 基因，AOB 和 AOA 的丰度， cbbM,oorA 等基因的丰度等 } 现可用便携式设备： LI-8100A 土壤碳通量自动测量系统：能够快速自动测量土壤CO2 通量 WET-2 土壤水分温度电导率速测仪：可在野外快速测量土壤的水分、温度、