分子生物学实验技术.pptxVIP

第1页/共42页分子生物学实验技术第2页/共42页一、基因克隆技术目的基因和载体限制性内切酶酶切DNA连接酶连接转化抗性筛选第3页/共42页基因克隆实验的一般过程获得基因序列：通过RT-PCR或基因组数据库获得引物设计及PCR扩增目的片段PCR产物连接到载体上构建成重组载体重组载体转化到大肠杆菌中进行质粒扩增或表达蛋白抗性筛选第4页/共42页质粒转化大肠杆菌的过程 感受态第5页/共42页+或非定向克隆第6页/共42页定向克隆克隆的片段只能按特定方向连接+第7页/共42页EcoR IHind IIIPCR扩增EcoR IHind IIIAAEcoR I+Hind III切EcoR I+Hind III切EcoR IHind IIIEcoR IHind IIIEcoR IHind III第8页/共42页（二）基因组DNA文库构建某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落（或噬菌体），所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库。外源DNA片断、载体、宿主构建基因文库的目的：筛选出感兴趣的目的基因第9页/共42页基因组DNA文库的构建基因组DNA文库的类型质粒文库 （﹤10kb)噬菌体文库（ 0-23kb)黏粒文库 ( ~45kb )酵母人工染色体文库 (又称大片段基因组DNA文库， 100kb—1Mb）第10