花药离体培养实验研究报告.docxVIP

花药离体培养实验研究报告 1花药离体培养中愈伤组织诱导研究 1.1生长调节物质对愈伤组织诱导的影响 在花药培养过程中,大部分小孢子退化,只有少部分小孢子发生分裂形成多核花粉粒,并进一步产生愈伤组织而撑破花药壁,这也是产生单倍体植株(或胚状体)的前提。培养过程中小孢子的去向主要有4种:萎缩、发芽、肥大和产生愈伤组织(或形成胚)。 大量试验结果证实,花药离体培养过程中,生长调节物质配比及含量对愈伤组织的诱导具有重要作用,显著影响出愈率,对愈伤的起源有重要调控作用[1-3]。在枣花药培养中,生长素对愈伤组织的诱导是必须的[4]。草莓花药培养中生长素和细胞分裂素对愈伤组织诱导均是必需的[5-6],于培养基中仅附加NAA时,花药不能被诱导产生愈伤组织,以IAA和BA相配合则可诱导出愈伤组织。在水稻花药培养中,KT可以显著促进愈伤组织的诱导,提高质量[7]。石刁柏花药离体培养试验证实,6-BA和NAA组合有利于其产生愈伤组织,如同时加入2,4-D则很难诱导出愈伤组织[8]。 Margaret Svensson等[9]也证实,合理的NAA与KT配比对愈伤组织的诱导是不可或缺的,较高的细胞分裂素可在一定程度上抑制花丝产生愈伤组织。有学者认为,某些生长素可与染色质的组蛋白结合,使组蛋白脱离DNA链,从而使DNA链活化,导致大量DNA的复制,促使细胞进行连续分裂而改变其原来正常的发育途径,形成愈伤组织。Nyman和Wallin[10]的试验也表明,培养基中一定量的TDZ同样有利于愈伤组织的诱导与分化。 1.2其他培养基成分对愈伤组织诱导的影响 基本培养基种类及各无机成分配比的变化对花药离体培养中愈伤组织的产生有决定性的影响。黄莺等[11]证实,提高培养基中微量元素倍数或降低大量元素的倍数有利于烟草花培出愈。对草莓花药培养而言,MS、White及F、GN等培养基均可作为愈伤诱导培养基。徐振南与万蜀渊[12]证实,较高的[NO-3]/[NH+4]比有利于草莓花药培养中愈伤组织的产生。无机成分中铁对多种植物花药培养中愈伤组织的产生有重要影响,螯合铁是必须的。 培养基中的有机成分对愈伤组织的诱导同样具有重要作用。碳源不但提供能源,还是渗透调节物质,对培养效果影响明显。多个试验表明,用麦芽糖替代蔗糖常常能取得更好的培养效果[13-14],但对同源四倍体水稻而言60 g/L蔗糖为碳源时诱导效果最好[7]。M argaret Svensson等[9]在草莓花药培养试验中发现,于培养基中附加脱乙酰古兰糖或再附加小麦淀粉可显著提高愈伤诱导率。小麦花药培养中,在培养基中加入水解乳蛋白或以葡萄糖替代蔗糖均促进愈伤组织的产生。在烟草和石刁柏花药培养时,于培养基中加入谷氨酰胺即可替代条件培养基对愈伤产生的促进作用[8]。 在双层培养中于固体层中加入活性炭(Ac)则会抑制愈伤组织的生长。多数人认为Ac之所以影响花药培养中愈伤组织的发生,是因为Ac不但可吸附花药组织解体所产生的抑制物(主要为酚类物质),而且同时也吸附培养基中的Fe-EDTA、VB6、V-B11、V-B5及生长调节剂。申书兴等[15]发现,在NLN培养基中添加Ac能明显促进四倍体及二倍体大白菜花药产生花粉胚,可大幅度提高胚产生率和胚状体发育的同步性,抑制愈伤组织的形成。而Fe盐的缺失会完全抑制Anemone canadensis花药培养中愈伤组织的发生。 1.3生理及环境因子对愈伤组织诱导的影响 花药培养中愈伤组织的诱导还受多种生理及环境因子的影响。 首先,花粉在接种时所处的发育时期可能比培养基更为重要,不同物种最适接种时期各异(多数为单核期或双核期)。此外,供试植株的生理状态对愈伤组织的产生也有影响,一般情况下幼年植株的花药对诱导的反应能力较强。 其次,接种前的预处理对愈伤组织产生也有明显影响,尤其在诱发小孢子脱分化方面作用明显。例如:低温(4℃)预处理(24～48 h)可促进草莓、羽衣甘蓝和石刁柏花药培养时产生更多愈伤组织[16-17,8]。申书兴等[15]研究认为小孢子培养开始时,热激处理(33℃,24 h)后25℃下培养能促进四倍体大白菜小孢子进行对称分裂,有利于愈伤组织的产生及获得大量胚状体。乔奇等[18]试验发现,消毒方法对花药愈伤组织的形成也有影响,但这可能与材料的生境有关。 另外,组织学研究证实,花药壁在花粉产生愈伤组织和形成花粉胚过程中对其有一定影响作用,只有贴靠在花药壁附近的花粉才能顺利实现脱分化。这说明绒毡层起源的某些重要物质的梯度变化对愈伤诱导有重要影响[19]。花药的长度及体积对其形成愈伤组织的能力也有影响。 2花药培养中的遗传变异 2.1倍性分离的研究 2.1.1普遍性花药培养中多倍体的形成是一个普遍现象。李士生[21]认为体细胞培养中多倍体的产生是由纺锤丝功能受阻而形成的重组核。