哈尔滨工程大学《分子生物学》课件-第3章复制.pptVIP

（4）真核生物DNA复制的终止 线形DNA的复制显然不存在生成环状分子的可能性，但它面临更严峻的问题。 以噬菌体T7的线形DNA复制的终止为例。T7的复制子原点在离一个端点14.9%处，其复制过程见图。 由于RNA引物的水解，两个 子代分子中，各有一个5’端 缺少一段核苷酸，而目前没 有已知的DNA聚合酶能填补。 然而又发现，T7DNA两端各有一段重复的数百个核苷酸，这称为末端冗余。它以这两个子代分子中的单链末端可以互补，多余的单链部分可以被polI弥补缺口。然后再由DNA连接酶连接起来，生成二聚体，这二聚体又称为连环分子。 生成的二聚体连环分子还可以通过复制产生四聚体、八聚体连环分子等。这一假说得到了有利的证实：在T7侵染细菌以后，分离到了巨大的T7连环分子，在任何时候，T 7DNA分子可以从这些连环分子上切下。 除了用连环分子的方法解决线性DNA在复制过程中所面临的问题外，还有线性DNA 采用环化的办法。例如λDNA在进入宿主细胞以后就环化并成为超螺旋形式。 有的噬菌体和病毒的线性DNA（RNA）借助于蛋白质的介入来解决分子末端复制问题，这些噬菌体或病毒编码的蛋白质能与5’末端的碱基共价连接。腺病毒、噬菌体φ29以及脊髓灰质病毒就采用这种手段。 （5）真核细胞DNA聚合酶 在真核细胞中存在3种DNA聚合酶，通常将这些酶依次称为DNA聚合酶α、β和γ。 与原核生物DNA聚合酶相同之处： （1）均以dNTP 为底物，需Mg+激活。 （2）聚合时必须有模板链和具有3’-OH末端的引物链。 （3）链的延长方向为5 ’ 3’。 与原核生物DNA聚合酶不同之处： 真核生物的DNA聚合酶一般都不具有核酸外切酶活性，推测一定有另外的酶在DNA复制中起校对作用。 位 置 聚合酶α 聚合酶β 聚合酶γ 聚合酶δ 活性比例 亚 基 数 分 子 量 抑制反应 真核细胞DNA聚合酶特性 DNA聚合酶α在细胞内的活性变化与DNA复制有明显的平行关系，在分裂细胞的S期达到高峰。目前认为它在细胞内DNA的复制中起关键作用。 DNA聚合酶β能以人工合成的多聚脱氧核糖核苷酸链为模板，以适当的寡聚脱氧核糖核酸链为引物合成DNA。此酶活性水平稳定，可能主要在DNA的修复中起作用。 DNA聚合酶γ能有效地利用人工合成的多聚核糖核苷酸链为模板，以脱氧核糖核酸链为引物合成DNA。γ聚合酶在分裂细胞中活性有明显变化，在细胞进入S 期后γ聚合酶的活性迅速上升两倍，然后回到正常水平，说明该酶可能在分裂细胞的DNA复制调控方面起作用。 （6）真核生物DNA复制的引发酶 引发酶分子量大约50KDa~60KDa。 ①引发酶与DNA聚合酶α形成紧密的复合物（可用50%乙二醇分开），这种复合物不但复制所必须的，而且与结合于复制原点的特异性蛋白质构成了复制体系的种族特异性。 例，来自人类HeLa细胞的复制体系，如果用DNA聚合酶抗体去除体系中的DNA聚合酶α和引发酶的复合物，则复制体系的其余组分不能支持SV40复制原点体外的复制（在大T抗原存在时）。如果加入人类HeLA细胞中的这种复合物或猴子COS细胞中的复合物，均能恢复复制能力。但加入小鼠或牛的复合物及大肠杆菌的DNA聚合酶Ⅰ和聚合酶Ⅲ均不能奏效。 ②真核生物的DNA引发酶的引物合成方式较为特别。 它的作用是阵发式的，每次作用能拷贝6个~15个核苷酸。当DNA聚合酶α缺少时，首次阵发性合成产物可以被下几次阵发性合成所延长成为很长的多聚核苷酸。但在有活性的DNA聚合酶α和足够的dNTP存在时，引物仅是第一次阵发性合成产物。 ③DNA引发酶不但能利用rNTP，而且还利用dNTP为合成前体。 在一次阵发性合成的引物中，第一个核苷酸总是rA，而以后的核苷酸要么都是核糖核苷酸，要么都是脱氧核糖核苷酸。而不能是二者都有。 由于引发酶能够少量的合成脱氧核糖核苷酸，因此精确确定DNA聚合酶α何时接替引发酶是很困难的。但引物一般只有6~15个核苷酸。 第三节 DNA复制的起始 一、前导链合成的起始：从新起始 二、前导链合成的起始：共价延伸 三、滞后链的前提片段的起始 一、前导链合成的起始：从新起始 能普遍适用于细菌和噬菌体的一个规律是：从新起始合成DNA发生在特定的DNA序列即复制原点之中，原核生物基因组一般只有一个复制原点，尽管有时主要复制原点因突变而丧失功能后有次要的复制原点取代它；由RNA聚合酶所进行的转录激活是不可缺少的；不同的基因组还需要不同的蛋白质以识别其复制原点并形成引发体。 1 复制原点与复制的起始，oriC和E.coli DNA 复制的起始 复制起始区的结构特点是： （1）A+T含量为56%，这数值低于多数噬菌体中A+T含量。 （2）含有多个回文结构（9－14个GATC），其中8个GAT