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克隆基因的方法第1页/共43页 2前言 基因是生物染色体上的一段DNA序列，具有转录、翻译成某种蛋白质调控生物生命活动的功能。第2页/共43页 3基因的表达过程mRNA翻译成蛋白质基因组DNA第3页/共43页 4如何获得基因？——即基因的克隆方法? 基于基因产物的基因克隆方法? 基于基因加标签的基因克隆方法? 基于基因序列的基因克隆方法? 基于基因图谱的基因克隆方法第4页/共43页 5一、 基于基因产物的基因克隆方法mRNA翻译成蛋白质1、根据蛋白质序列克隆目的基因2、根据基因表达差异（mRNA）克隆基因第5页/共43页 6 原理：根据蛋白质上的一段多肽的氨基酸序列，反推核苷酸序列，然后设计探针或引物从基因组文库或cDNA文库中分离出相应的基因。1、蛋白质序列克隆法第6页/共43页 7实用性： 分离纯化蛋白质十分困难Cys Met Asp Glu Met Lys Arg Asn IleTGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATA C T GATG G G T T C据某段氨基酸序列推导可能的核苷酸序列注意！密码子有简并性现象！第7页/共43页 82、根据基因表达差异（mRNA）克隆基因基因表达的差异表现：?一是基因表达的种类的不同；?二是基因表达水平的改变。第8页/共43页 9? 差减杂交（SH）? 抑制性差减杂交（SSH）? 差异显示PCR（DD RT-PCR）? DNA代表性差异分析（DNA RDA）? 扩增限制性片段长度多样性（AFLP）? cDNA微阵列已发展的相应基因克隆方法：第9页/共43页 10? 差减杂交（SH）最早由Lamar和Palmer于1984年提出并用于雄鼠Y染色体的DNA研究。超声波打断雌鼠的DNA（过量100倍）(XX)MboI完全消化雄鼠的DNA (XY)变性、复性去除共有序列BamHI酶切表达载体连接、转化、测序分析缺点：技术要求高，耗时，工作量大NO.1NO.2NO.3第10页/共43页 11SH在mRNA研究上的应用机理： !!不足之处：重复性差，灵敏度低，回收的cDNA量有限。特异表达基因的样本（TS）无特异表达基因的样本（RS）提取mRNA提取mRNAcDNAcDNA转录转录过量杂交TS的CDNA纯化、富集、扩增去除过量的RS的cDNA及杂交分子第11页/共43页 12? 基因突变体的研究：如基因的表达与不表达；? 基因时空表达的研究：如根、茎、叶；? 不同处理条件下的基因表达差异：如施肥与不施肥、光照与不光照。差减杂交技术的应用方面：第12页/共43页 131.2.2 抑制性差减杂交（SSH）Tester样本mRNADriver样本mRNASfiI AcDNAcDNASfiI BAB混合，变性杂交过量ABPCR扩增5`3`第13页/共43页 14应用基因突变体的研究：如基因的表达与不表达基因时空表达的研究：如根、茎、叶不同处理条件下的基因表达差异：如施肥与不施肥、光照与不光照第14页/共43页 151.2.3 差异显示PCR（DD RT-PCR）最先由Liang等于1992年报道，目前已广泛在实验室使用。主要原理：利用真核生物mRNA结尾处有POLY（A）结构，在其3`端设计象5`-T11GA样引物，该引物可与mRNA总数的十二分之一结合，从而使这部分基因得到逆转录，同时结合5`端的随机引物（20条10-mer），可以使不同长度的基因得到扩增。5`3`AAAAAAAAATGCAGCTTTTTTTTTTRPmRNA第15页/共43页 165`3`AAAAAAAAATGCAGCTTTTTTTTTTRPmRNAAATTTTTTTTACTTTTTTTTAGTTTTTTTTTATTTTTTTTTCTTTTTTTTTGTTTTTTTTCATTTTTTTTCCTTTTTTTTCGTTTTTTTTGATTTTTTTTGCTTTTTTTTGGTTTTTTTT第16页/共43页 17第17页/共43页 18具体操作：1、提取mRNA；2、特定引物（12分之一）反转录；3、特定引物和RP结合RT-PCR；4、把不同处理的样品扩增产物按引物组合分别进行电泳比较DNA带，从而找出差别DNA。第18页/共43页 19缺点：假阳性条带多，对低丰度的基因表达不容易检测。工作量大。无法定量研究。扩出的条带往往是3`端比较短的UTR区的一段序列，提供的信息较少。第19页/共43页 20 优点：简便、灵敏、高效、省时，能快速显示mRNA的组成。所需的mRNA量少。各样本mRNA的差异可同时进行比较。扩出的cDNA可直接用于测序、文库筛选等。第20页/共43页 21二、基于基因加标签的基因克隆方法原理：主要