分解纤维素的菌的分离与提纯.pptxVIP

分解纤维素的菌的分离与提纯 第1页/共16页 目的意义 实验用品 实验方法与流程 实验结果 分析与讨论 致谢 第2页/共16页 目的意义 能源危机、环境污染日益严重，在迈入21世纪今天，已成为人类面临的两大难题。寻找新能源，减少环境污染，越来越显得重要。纤维素是植物光合作用的主要产物，利用微生物可将纤维材料转化为能源、饲料、化工等原料。 筛选出降解纤维素的菌株有助于投入生产，在能源、工业生产等作为理论参考。 第3页/共16页 实验用品 培养基： 羧甲基纤维素钠培养基（初筛培养基） ： CMC-Na 3.0g (NH4)2SO4 2.0g K2HPO4 1.0g MgSO4﹒7H2O 0.5g 胰蛋白胨 1.0g 琼脂 20g 刚果红培养基（复筛培养基）：CMC-Na 3.0g (NH4)2SO4 2.0g K2HPO41.0g MgSO4﹒7H2O 0.5g 胰蛋白胨 1.0g 琼脂 20g 刚果红 0.0692g 水 1000ml PH 7.0 发酵产酶培养基：CMC-Na 10.0g (NH4)2SO4 4.0g KH2PO4 2.0 MgSO4.7H2O 0.5g H2O 1000ml PH 6.0 主要仪器： 紫外分光光度计 UV-2550型 高速离心机 HC-2518型 主要试剂： 3,5-二硝基水杨酸 羧甲基纤维素钠 第4页/共16页 实验方法与流程 样品采集 初筛 复筛 酶活力测定 取文汇山落叶覆盖下的腐殖土、延河河泥 将土样按浓度梯度配置成菌悬液，取1ml涂布到以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的平板上，与培养箱中培养，多次平板划线分离纯化得到纯菌株 。 将初筛得到的菌株点样于刚果红培养基上进行复筛，,培养2d。采用十字交叉取平均值法，测量降解圈及菌落直径R1，R2。根据R1/R2的值，筛选出比值最大的几株菌。 还原糖测定为DNS试剂法540nm处有最大吸光值，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强弱成比例关系。根据产生葡萄糖的量间接作为酶活力衡量标准。 第5页/共16页 标准曲线的绘制 配置1mg/mL的葡萄糖标准液，取9只具塞试管，分别编号0、1、2、3、4、5、6、7、8，按下表加量： 项目 0 1 2 3 4 5 6 7 8 葡萄糖标准液/ml 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 相当于葡萄糖量/mg 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 蒸馏水/ml 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 DNS试剂/ml 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 酶活力测定具体步骤: 粗酶液的提取 取10mL试管，加入 6mL1.0%羧甲基纤维素钠溶液，再加入不同菌株提取的粗酶液，50℃水浴中酶解30min，加2.0mLDNS溶液，沸水浴8min，取出于冷水中冷却至室温，定容10.0mL，在540nm下测吸光值 混匀后，放入沸水中，准确沸水浴8分钟，取出 冷却至室温，加入21.5ml蒸馏水，以0号为对照 在540nm下测定其OD值，绘制葡萄糖标准曲线 用接种环从试管里取一环活化后的菌株，加入到产酶发酵培养基上培养，每隔一天取一定培养液，离心（8000r/min,10min）取上清液，即为粗酶液。 第6页/共16页 实验结果 经过多次分离纯化，共分离出9株菌；接种到刚果红培养基上筛选 名称 ML-1 SX-2 WZ-3 WX-4 WD-5 LT-6 LH-7 BF-8 ZP-9 降解圈直径R1(cm) 1.6 1.2 1.45 1.5 2.1 1.35 1.35 1.65 1.55 菌落直径R2 (cm) 0.35 0.4 0.36 0.35 0.3 0.32 0.32 0.32 0.42 R1/R2 4.57 3.00 4.03 4.27 7.00 4.22 4.22 5.16 3.69 十字交叉法测得菌落及降解圈的直径如下表： 由表中数据，挑选出ML-1，WD-5,BF-8R1/R2比值最大的三株菌 第7页/共16页 对所筛出的三株菌进行镜检得到图片如下： ML-1 WD-5 BF-8 ML-1 WD-5 BF-8 革兰氏染色结果 阴性（红色) 阳性(蓝紫色) 阴性(红色) 细菌形态 杆状 杆状 杆状 WD-5 BF-8 WD-5 WD-5 BF-8 WD-5 WD-5 BF-8 WD-5 WD-5 BF-8 WD-5 第8页/共16页 生理生化实验结果 ML-1 WD-5 BF-8 VP实验 - +