实验五：酶联免疫吸附法测定抗血清效价.docxVIP

实验五酶联免疫吸附法测定抗血清效价 \目的 学习和掌握ELISA的基本原理 重点掌握 间接ELISA 测定抗体效价的方法 测量肘，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍 保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成 的偶联物（标记物）,此偶联物仍保留其原免疫活性与 酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结 合后, 再加上酶的 相应底物， 即起催化水 解或氧化还 原反应而呈 颜色。 Sutoslrato (color reaction) ELISA REAGENTS FaLV in serum ugated antibody 2 Afifi-FelV 时枇 (capture antib hi* 1 其所生成的颜色深浅与 欲测的抗原（抗体）含量成 正比。 这种有色产物可用肉眼、 光学显微镜、电子显微镜观 也可以用分光光度计 （酶标仪）加以测定。 其方法简单，方便讯速, 特异性强。 二、酶及其底物 ElEl酶结合物是酶与抗体或抗原，半抗原 在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败 的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的 免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物 放大作用，但不同的酶选用不同的底物， 将得到不同的颜色反应. El El 显色 反应 辣根迎氧化物酶 邻苯二胺 四甲替联苯胺 氨基水杨酸 邻联苯甲胺 2, 2」连胺基-2 (3-乙基-并嚏 哩琳横酸-6)锻盐 晦性磷酸館酶 ilf 4-硝基酚磷酸盐(PNP) 荼酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐 葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+葡萄* 葡萄糖+甲硫酚嗪+唾哩兰 测定波长 6-D-半乳親 昔酶 甲基伞酮基半乳糖S (4MuG) 硝基酚半乳糖Q (ONPG) 1! 橘黄棕兰蓝 色 色红色色色绿 黄色红色 黄色 深蓝色 荧光 黄色 400 500 405 420 360,450 420 ELISA的种类和变化 (-)双抗体夹心法 (-)间接法 (=)竞争法 双位点一步法 捕获法测IgM抗体 应用亲和素和生物素的ELISA ■首先将抗原或抗体吸附在一个合适的固体载体直接法原理△ △ △ ■首先将抗原或抗体吸附在一个合适的固体载体 直接法原理 △ △ △—— △ △ △ △ ■ — 抗原 表面上，洗涤 ■然后以酶标记的抗原或抗体与被吸附 的相应抗体或抗原结合形成有酶标记 的抗原?抗体复合物，洗涤 ■当加入适合底物时，复合物上的酶即 催化底物发生反应，产生带色的产物。 因在一定条件下，酶降解底物的量与 呈现的色泽成正比关系，因此通过分 光光度计测定色度，即可计算出参与 反应的抗原或抗体的含量。 △△△△△△△一底物*标二抗间接法 △△△△△△△一底物 *标二抗 间接法 一抗 抗原 III 间接法的原理 ■先将抗原吸附于载体表面，洗去未吸附 的部分， ■然后加入待测血清，使其中的特异抗体 蛋白（第一抗体）与抗原结合物，再洗 去未结合的初底 ■加入酶抗体的抗体（第二抗体，即第一 抗体的抗体），与抗原?抗体复合物相 结合，产生酶标记的免疫复合物，洗去 未结合的酶标记物， ■加入底物，在酶的催化下产生有色物质, 通过比色测定光密度值，即可算出抗血 清中抗体的存在量。 抗血清效价 III■制备的免疫血清，必需进行效价的测定。 III ■抗血清的效价：它与一定量抗原作用时出现肉眼 可见颜色反应的最大稀释度。 III■分光光度计测定法：应用一系列连续稀释的抗血 清，与固定的抗原反应，分析计算出现颜色的最 大稀释度（吸光度差值需大于0.05） O III 三、操作步骤 ■ 1.包被：96孔板包被适量BSA (100 ul) , 4C过夜。 2.洗涤：漂洗3次，每次300 ul,每次3 min。 3.—抗孵育：加入稀释的一抗(100 ul) , 37°C孵育Ihr。 4.洗涤：漂洗3次，每次300 ul,每次3 min。 ,,5.二抗孵育：加入稀释的酶标二抗(100 ul) , 37C孵育30 min。 ,, ■ 6.洗涤：漂洗3次，每次300 ul,每次3 mine ■ 7.显色反应：加入显色液200 ul,避光显色15 mine 8.终止：加入2N(N:当量浓度)H2SO4 50 ul,终止反应。 9.测定：酶标仪读数(OD490读数)o 四、实验报告要求 1.原理（铅笔绘图） ■2.操作 .3,结果 4.曷果说明（判断本实验中抗体的效价？） 抗体浓度 对照（0） 1:500 1:1000 1:2000 1:4000 1:8000 一抗 洗涤液 ① ② ③ ④ ⑤ 二抗 二抗 二抗 二抗 二抗 二抗 二抗 。。490 ELISA应用实例 ELISA在饲料安全检测中的应用 斌饲料中盐酸克伦特罗的测定 ?饲料中毒素的测定（主要包括黄曲霉毒素, 简曲霉毒素） 囑饲料中有害微生物的快速筛检（如沙门氏