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精品 精品 实验三：免疫印迹 1原理 免疫印迹又称 Western印迹（Western blotting）,与DNA的Southern印迹技术相 对应，两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一神固相载体（通常为NC腹）， 然后用探针检测特异性组分。不同的是，Western bk.tting所检测的是抗原类尽白质 成分，所用的採针是抗体，它与附着于固相载体的耙昼白所呈现的抗原表位发生 特异性反应。该技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异敏感等诸多优 点，具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测，以及从多克隆抗体中 检测出单克隆抗体的优越性。该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的 水平而无需对祂書白进行放射性标记。3 , Western bk.tting广泛用于齊白质研究、 基础研究和临床医学的研究。 免疫印迹可分成两个步骤：蛋白质由凝胶转移至固相基质；特异性抗体检测。 番白质转移通常由电泳实现，现常用的方法有二：1半干法：将凝胶和固相 基质似三明治样夹在缓冲液湿润的滤纸中间，通电10-30分钟可完成转移；2涅法： 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电45分钟或过夜 课完成转移。本试验采用湿法转移。免疫印迹用.腹通常有硝酸纤维素膜和尼龙膜 两种。大多数应用前者。本实验也用硝酸纤维素膜进行转移。 转移结東后，蛋白质的检测可分成三个步骤进行：首先，将膜同特异性抗体 孵育数小时或过夜，然后将膜同可特异性识别上述抗体（一抗）的第二抗体（二 抗）孵育，通常二抗连接有如辣根过氧化物蒔等标记物。冃的毒白可由该,催化 的显色反应在膜上形成有色产物加以检测。本实验用的是码标抗IgG,＜不加一抗。 2试剂与仪器 2.1试剂（所有试剂均供两组用） 2-1-1转移缓冲液 Tris 3.025g 甘氨酸14.413g 甲醇 2（）mL 加恭傷水约800mL,调pH至8.3,定容IGOOmL 2.1.2 Tris缓冲曲溶液（TBS） Tris 2.42g NaCl 27.750g 加恭籍水约800mL,週pH至7.5,定容1000mL 2.1.3 TTBS TBS 80()mL Twrrn-20 400)11 2.1.4封闭液及抗体稀释液 脱脂奶粉 0.3g TBS 100mL 2.1.5 底物溶液 二象基联苯胺(DAB) 5.0mg TBS 18mL H2O, 20讨 临用前配 2.1.6丽春红总蛋白质染色液 丽春红lg 4% 乙酸 IGOmL 5%小牛血清生理盐水 小牛血清 7.5mL 0.85%生理盐水定容至150mL 鶴标抗 IgG (1: 1500) 离标抗】g(； 0.1 mL 5%小牛血清生理盐水定容至150mL 2.2仪器 夹心式电泳槽，电泳仪，硝酸纤维素膜，直径9cm珞葬皿，聲刀，银 子，刀片，微量移液枪，普通滤纸 3试验步骤 3.1 SDS电泳分离 所需试剂、仪器以及分离步骤完全与实验六相同，故此处从咯。不同之处如下： 3.1.1样品制备：取人血清0.1ml,加稀释5僖的上样缓冲液0.5ml,振摇后 1 ()0()0rp/5min离心，取8(叫上清液加入等体积的样品缓冲液，在沸水浴中加热3min。 瞬间离心，取上清液上样。 3-1.2加样：拔出梳子，用电极缓冲液冲洗样品槽后加样。上样量从左到右为5 、20、15、10、5、5、5、5、10、15、20、5卩1 （从中间分开，两侧对称）。 3.1.3电泳：稳流10mA电泳，当滾酚苣指示剂前沿到达距底部1cm左右时，停止 电泳。取出胶，将点有样品的胶条从中间切成两条，一条用常规方法染色和脱色, 另一条用于转移和蒔联。 3.2转移蛋白质到硝酸纤维素膜上（电转移） 3.2.1切割与放尺寸相符的硝酸纤维素膜，用转移缓冲液浸泡5min使没有气泡。 3.2.2剪2张滤纸与胶尺寸大小相符，将其与海绵一起浸泡在转移缓冲液中。 323打开转移槽的胶板，依次放入：a. —张浸湿的海绵；b. 一张用转移缓冲液 饱和的滤纸；c.用转移缓冲液冲洗过的胶，并小心的赶走滤纸和放之间的气泡； d.硝酸纤维素膜，正面对着放，在胶和.腹的右下角剪一小角，以标明方向；u — 张用转移缓冲液饱和的滤纸；￡ 一张浸湿后的海绵。 3.2.4小心的合上胶机，并立即放入转移电泳槽中。加转移缓冲液至满。 3.2.5插好电极，注意正负极方向，胶侧为负，NC膜侧为正。打开电泳仪开美调 至稳压60v,电泳2h,转移结束后打开胶板取出硝酸纤维素薄膜。 3.3膜的蔭联免疫染色 3.3.1用丽春红溶液检验转移是否成功，若显色清楚，用蒸憎水冲洗，TBS洗，腹 Imiiio 3.3.2将膜放入培养皿中。加封闭液后在37°C摇床上搖动6（）min。 3.3.3取出膜，用TTBS洗膜3次，每次3min,将腰放入另一个培养